[发明专利]一种pCUP1载体质粒的构建及其应用

权利要求书

1.一种外源基因高拷贝稳定插入的重组毕赤酵母筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括：

采用EcoRI限制性核酸内切酶和NotI限制性核酸内切酶对pCUP1载体质粒进行双酶切，得到酶切产物，后采用电泳回收酶切产物，得到酶切后的pCUP1载体质粒；

采用PCR扩增体系对外源基因进行扩增，得到外源基因PCR产物，后采用电泳回收所述外源基因PCR产物，得到外源基因片段；

将所述外源基因片段与所述酶切后的pCUP1载体质粒进行连接，得到pCUP1-外源基因表达质粒；

采用Sac I限制性核酸内切酶将所述pCUP1-外源基因表达质粒进行线性化，得到线性化pCUP1-外源基因表达质粒；

采用所述线性化pCUP1-外源基因表达质粒转化X33毕赤酵母感受态细胞，后涂布YPDS-Zeocin平板，培养，得到第一菌落；

将所述第一菌落接种于第一BMGY液体培养基，得到培养物，将所述培养物接种于第二BMGY液体培养基，得到菌液；

采用第三BMGY培养基重悬所述菌液，后涂布第三BMGY平板，培养，得到重组毕赤酵母高拷贝菌落；

其中，

所述YPDS-Zeocin平板包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，浓度为2％的葡萄糖，浓度为1mol/L的山梨糖醇，浓度为2％的琼脂，浓度为100μg/ml的Zeocin；

所述第一BMGY液体培养基包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，浓度为100mM、pH为6.0的磷酸二氢钾，浓度为1.34％的YNB，浓度为4x10^-5％的生物素，浓度为1％的甘油，浓度为0.3mM的硫酸铜；

所述第二BMGY液体培养基包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，浓度为100mM、pH为6.0的磷酸二氢钾，浓度为1.34％的YNB，浓度为4x10^-5％的生物素，浓度为1％的甘油，浓度为1mM的硫酸铜；

所述第三BMGY培养基包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，浓度为100mM、pH为6.0的磷酸二氢钾，浓度为1.34％的YNB，浓度为4x10^-5％的生物素，浓度为1％的甘油，浓度为2mM的硫酸铜；

所述第三BMGY平板包含：浓度为1％的酵母提取物，浓度为2％的蛋白胨，1.5％琼脂糖，浓度为100mM、pH为6.0的磷酸二氢钾，浓度为1.34％的YNB，浓度为4x10^-5％的生物素，浓度为1％的甘油，浓度为2mM的硫酸铜；

所述pCUP1载体质粒的构建方法如下：

采用PCR扩增体系对酿酒酵母中的CUP1基因进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收所述PCR产物，得到CUP1基因片段；

采用BamH I限制性核酸内切酶对pPICZαA载体进行酶切，得到酶切产物，采用电泳回收所述酶切产物，得到酶切后的pPICZαA载体；

将所述CUP1基因片段与所述酶切后的pPICZαA载体进行连接，得到所述pCUP1载体质粒；

其中，

所述PCR扩增体系中的扩增引物为：

上游引物F：5'TGAGACCTTCGTTTGTGCGcaatagaggcaggtatc，

下游引物R：5'ATGGTGTGTGGGGGATCattcctttaattgctaa；

所述PCR扩增体系为100ul，其包括：

10×扩增缓冲液10ul，dATP 200umol/L，dGTP 200umol/L，dTTP 200umol/L，dCTP200umol/L，所述上游引物F10～100pmol，所述下游引物R10～100pmol，模板DNA 0.1～2ug，Taq DNA聚合酶2.5u，Mg²⁺ 1.5mmol/L，余量为双蒸水和/或三蒸水；

所述PCR扩增体系的反应条件为：

依次序在温度为94℃下变性60秒、在温度为55-60℃下退火60秒、在温度为72℃下衍生120秒，并重复25-30个循环。