[发明专利]一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒和方法

权利要求书

1.一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒，其特征在于，含有以下物质：

(A)用于检测T790M位点的上游引物、下游引物，所述引物的序列为：

上游引物：5’-GGCATCTGCCTCACCTCCA-3’；

下游引物：5’-GACATAGTCCAGGAGGCAGC-3’；

(B)用于检测T790M位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针，所述荧光探针的序列为：

突变型荧光探针：5’-GAGCTGCATGATGAG-3’；

野生型荧光探针：5’-GAGCTGCGTGATGAG-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变型荧光探针和野生型荧光探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光报告基团选自HEX、TexasRed、CY5、CY5.5、CY3、FAM或VIC；所述的淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述突变型荧光探针连接的荧光报告基因为FAM，淬灭基团为BHQ1；所述野生型荧光探针连接的荧光报告基团为CY3，淬灭基团为BHQ2。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测T790M位点的上游引物、下游引物和用于检测T790M位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针，以引物探针混合液的形式存在，共同溶解于TE缓冲液中，制成引物探针混合溶液。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括反应预混液、阳性质控品和阴性质控品，所述反应预混液包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP、镁离子、BSA、热启动Taq酶和扩增增强剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增增强剂包括焦磷酸酶和TritonX-100。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的试剂盒在如下任一项中的应用：

(1)制备用于检测肺癌患者EGFR基因是否发生T790M位点突变的产品；

(2)制备用于检测肺癌患者服用EGFR-TKI是否发生耐药的产品。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。

10.一种用于非诊断目的检测EGFR基因T790M位点突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)待测的DNA模板、权利要求1所述试剂盒中的上游引物和下游引物、

突变型探针和野生型探针与权利要求6所述的反应预混液混合，制备得到数字PCR混合液；其中的DNA模板、上游引物、下游引物、突变型荧光探针和野生型荧光探针的含量如下：

a：DNA模板的含量为0.25-2ng/μL；

b：上游引物和下游引物的含量均为0.3-0.7μM；

c：突变型荧光探针和野生型荧光探针的含量均为0.2-0.4μM；

(2)用数字PCR混合液制作PCR微反应单元，再进行PCR扩增反应，PCR扩增条件为：93-97℃预变性3-15min；93-97℃变性5-50s，60-70℃退火5-50s，55-65℃延伸10-65s，共进行20-60个循环；2-10℃终止反应；

(3)PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有EGFR基因T790M位点突变的DNA模板及其数量和含量。