[发明专利]基于Cas9-sgRNA的病毒LTR免疫沉淀筛选调控病毒转录靶标

权利要求书

1.一种筛选与病毒LTR互作蛋白的方法，或筛选调控病毒转录靶标的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)制备针对病毒LTR区域的复合物Cas9-sgRNA；2)将复合物Cas9-sgRNA与含有病毒LTR的细胞裂解液孵育；3)Cas9免疫沉淀富集与LTR互作的蛋白。

2.权利要求1所述的筛选与病毒LTR互作蛋白的方法，或筛选调控病毒转录靶标的方法，其特征在于，所述步骤1)制备针对病毒LTR区域的复合物Cas9-sgRNA进一步包括：a.设计和制备特异性靶向LTR的sgRNA，b.体外制备Cas9，c.制备复合物Cas9-sgRNA。

3.权利要求2所述的筛选与病毒LTR互作蛋白的方法，或筛选调控病毒转录靶标的方法，其特征在于，所述a还包括有效靶向LTR sgRNA的快速鉴定步骤，将不同sgRNA序列分别构建至含有Cas9的PX459载体质粒，将该质粒与含有LTR作为启动子的luciferase报告质粒共转入细胞，基于luciferase表达量筛选有效sgRNA；所述b中制备的Cas9为标签化的Cas9；所述c，采用标签化的Cas9和sgRNA分别定量后，按Cas9:sgRNA摩尔数＝1:3孵育。

4.权利要求1-3任一所述的筛选与病毒LTR互作蛋白的方法，或筛选调控病毒转录靶标的方法，其特征在于，所述步骤2)中含有病毒LTR的细胞裂解液制备如下：细胞中转染LTR质粒，经固定后离心收集细胞，加入含有蛋白酶抑制剂和DTT的SDS裂解液重悬细胞，重悬细胞进行DNA片段化处理；所述步骤3)免疫沉淀富集与LTR互作的蛋白，采用Flag-beads进行孵育；将带有DNA产物的beads经洗脱，获得蛋白产物。

5.权利要求4所述的筛选与病毒LTR互作蛋白的方法，其特征在于，步骤2)中所述DNA片段化获得500bp到1000bp之间的DNA片段。

6.权利要求1-5任一所述的筛选与病毒LTR互作蛋白的方法，或筛选调控病毒转录靶标的方法，其特征在于，所述方法进一步包括步骤4)：鉴定与LTR互作的蛋白；所述鉴定方法为免疫印迹、质谱分析或测序分析。

7.权利要求1-6任一所述的筛选与病毒LTR互作蛋白的方法，或筛选调控病毒转录靶标的方法，其特征在于，所述病毒为HIV病毒。

8.权利要求1-7任一所述的筛选与病毒LTR互作蛋白的方法，或筛选调控病毒转录靶标的方法，其特征在于，所述Cas9蛋白为失活的Cas9蛋白。

9.权利要求2-8任一所述的筛选与病毒LTR互作蛋白的方法，或筛选调控病毒转录靶标的方法，其特征在于，所述sgRNA为SEQ ID NO.5、6、7所示任意或组合的sgRNA。

10.一种基于Cas9-sgRNA的病毒LTR免疫沉淀在筛选与病毒LTR互作蛋白中的应用，或在筛选调控病毒转录的靶标中的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：1)制备针对病毒LTR区域的复合物Cas9-sgRNA；2)将复合物Cas9-sgRNA与含有病毒LTR的细胞裂解液孵育；3)Cas9免疫沉淀富集与LTR互作的蛋白。

11.一种筛选与病毒LTR互作蛋白的系统，其特征在于，所述系统包含Cas9蛋白、sgRNA和病毒LTR以及相应免疫沉淀组分，所述系统实现如下步骤：1)制备针对病毒LTR区域的复合物Cas9-sgRNA；2)将复合物Cas9-sgRNA与含有病毒LTR的细胞裂解液孵育；3)免疫沉淀富集与LTR互作的蛋白。

12.权利要求11所述的筛选与病毒LTR互作蛋白的系统，其特征在于，所述系统为试剂盒。