[发明专利]一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构建方法和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及特异性靶向抗生素抗性基因tetA的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体及其构建方法和应用，即一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构建方法和应用。本发明通过对四环素类抗性基因tetA的序列分析，筛选出靶向切割tetA基因的上述sgRNA序列。经实验验证，本发明提供的CRISPR/Cas9敲除载体能够高效靶向切割tetA基因第251位至第270位序列。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及特异性靶向抗生素抗性基因tetA的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体及其构建方法和应用。

背景技术

近年来，随着抗生素在畜禽养殖和临床治疗中的大量使用，环境中抗生素抗性细菌以及抗生素抗性基因的丰度正在不断增加。抗生素抗性基因会使细菌产生抗生素耐药性，目前已被当做一种新型的环境污染物。四环素类抗生素是由放线菌产生的或半合成的一类广谱抗生素，由于价格低廉，不仅被作为药物用于治疗人类或动物的细菌感染，同时也被作为常用的饲料添加剂，用于提高饲料利用率，促进养殖动物的生长。四环素的滥用导致了四环素抗性基因在细菌间广泛传播，这使得四环素的治疗效果不断被削弱，对人和动物有着潜在的健康风险。tetA基因是四环素抗性基因中的重要一种，目前在土壤，地表水，大气，污水处理厂、沉积物等环境中都被广泛检出。

目前，抗生素抗性基因的削减主要是通过微生物群落结构的改变，例如，通过过滤的方式减少微生物的生物量。但这些方式都没有从根本上破坏抗性基因，系统中残余的抗性基因仍能通过整合、转座以及接合转移等途径进行迁移转化。CRISPR/Cas9系统是近年来新兴的基因编辑技术，Cas9蛋白能在特定guide-RNA的引导下靶向切割特定序列。一些研究者利用CRISPR/Cas9系统对大肠杆菌等多种微生物的功能基因进行了敲除，但目前利用该系统对四环素抗性基因敲除的研究还较为缺乏。

发明内容

本发明的目的在于提供特异性靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体及其构建方法。

第一方面，本发明所涉及的sgRNA序列靶向tetA基因的第251位至第270位序列，Cas9蛋白在该sgRNA的引导下对该位点有良好的切割效果，该sgRNA的特异性核苷酸序列如sgRNA-1(为SEQ ID No.1)所示。

sgRNA-1：5’-CATGATGGCGTAGTCGACAG-3’。

第二方面，本发明提供了包含上述特异性靶向tetA基因第251至第270位核苷酸序列的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体，优选的，CRISPR/Cas9基因敲除载体图谱如附图3所示。

上述CRISPR/Cas9基因敲除载体为单质粒系统，即运用同一个质粒载体表达基因敲除所需要的Cas9蛋白和sgRNA。

第三方面，本发明提供上述CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，其为：将Cas9蛋白基因，上述sgRNA基因，接合转移位点，复制子，筛选标记基因通过无缝克隆的方法得到上述的CRISPR/Cas9基因敲除载体。

上述CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建包含以下步骤：