[发明专利]一种牙髓干细胞条件培养基及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种牙髓干细胞条件培养基的制备方法，包括如下步骤：取牙髓组织剪碎后分离出牙髓干细胞进行培养，然后消化传代，取第三至五代的牙髓干细胞继续培养，待细胞达到70‑80％汇合率时弃培养基，清洗后替换无血清培养基继续培养，收集培养基离心后取上清液，用滤器过滤，再装入超滤离心管中离心浓缩，即得。该制备方法可以获得浓度高、纯度大的牙髓干细胞条件培养基，具有时间短、操作简单、价格便宜、不易污染的优点，大大提高了实验的效率。本发明还公开了该牙髓干细胞条件培养基在改善低氧诱导颏舌肌细胞损伤中的应用，本发明制备得到的牙髓干细胞条件培养基能更有效的提高颏舌肌细胞活力，减少细胞内和线粒体内氧化应激产生。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及人牙髓干细胞条件培养基及其制备方法，以及该条件培养基在改善低氧诱导颏舌肌细胞损伤中的应用。

背景技术

颏舌肌属于骨骼肌，是牵拉舌体向前运动的主要肌肉，被称为“上气道安全肌”，其功能异常与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSA)的发病密切相关。OSA患者在频繁的呼吸暂停期间，长期缺氧的状态下颏舌肌代偿性收缩增强，持续的代偿性收缩易导致肌肉疲劳，从而进一步加重上气道塌陷程度，形成恶性循环，影响肌肉的结构与功能。

牙髓干细胞是一类由神经脊发育且位于牙髓组织内的间充质干细胞，具有高度增殖能力和多向分化潜能。相较于其他来源的间充质干细胞(如骨髓、脂肪、脐带血等)，牙髓干细胞可从因正畸需要而拔除的健康前磨牙和第三磨牙中分离培养，取材方便、创伤小，不存在道德伦理问题。当然，也与其他间充质干细胞类似，具有分泌多种蛋白和因子的旁分泌功能，这些因子已被证实具有免疫调节、抗凋亡、抗氧化、促血管生成和促细胞迁移等作用。在体外这些分泌物主要存在于培养细胞的上清中，又被称为条件培养基(conditionedmedium,CM)。CM的使用可以克服与细胞使用相关的问题，例如高成本，安全问题，质量管理，同种异体细胞引起的免疫排斥，肿瘤形成的风险以及植入细胞长时间不能存活的事实，又被称为“无细胞治疗”。但是，目前传统制备方法获得的条件培养基中的营养物质已经被间充质干细胞消耗了一部分，分泌物含量不高，浓度达不到保护作用的要求，再用于细胞实验会衰减原有的效果。并且现有的提取条件培养基分泌物的技术价格昂贵，周期长。

因此，提供一种浓度高，纯度大，操作简便，效果优良的制备牙髓干细胞条件培养基的方法，可以更有效地应用于改善低氧诱导颏舌肌细胞的损伤，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种浓度高，纯度大，操作简便，效果优良的制备牙髓干细胞条件培养基的方法，更有效的应用在改善低氧诱导颏舌肌细胞的损伤。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种牙髓干细胞条件培养基的制备方法，包括如下步骤：

(1)分离培养：取牙髓组织并将其剪碎，然后采用酶消化法分离牙髓干细胞，在DMEM完全培养基中培养，当细胞从组织块爬出或贴壁生长至80-90％汇合率时用胰酶消化传代，直至传到第三代至第五代的牙髓干细胞；

(2)条件培养基的收集：取所述步骤(1)后得到的牙髓干细胞进行继续培养，待细胞达到70-80％汇合率时弃培养基，用PBS清洗后替换无血清DMEM进行培养，收集培养基；

(3)浓缩条件培养基的制备：将所述步骤(2)后收集到的培养基进行第一次离心后取上清液，用滤器过滤，再装入超滤离心管中离心浓缩，取出内管中的液体即为浓缩的牙髓干细胞条件培养基。

上述的制备方法，优选的，所述步骤(1)中，所述采用酶消化法分离牙髓干细胞的具体操作包括如下步骤：将剪碎的牙髓组织置于I型胶原酶和Dispase酶的1:1体积比的混合酶中进行消化，消化温度为37℃，每15min摇晃一次，共消化45min-1h，消化完成后用1000r/min离心3min，得到分离的牙髓干细胞。