[发明专利]一种大规模生产黄芪毛状根的方法

说明书

本发明提供了一种大规模生产黄芪毛状根的方法，包括黄芪无菌苗的制备、农杆菌的活化和培养，毛状根的预培养和共培养，毛状根的扩大培养步骤，该方法制备得到的黄芪毛状根具有高的黄芪甲苷含量，同时，本发明所述方法具有可在保证黄芪甲苷含量的基础上，稳定高产黄芪毛状根，并有生产周期短、生产品质统一、适应常温生长条件的优点。

技术领域

本发明涉及一种大规模生产黄芪毛状根的方法，属于黄芪生物技术培育技术领域。

背景技术

黄芪属于豆科多年生草本植物，以根入药，迄今已有2000多年的历史。黄芪的主要药理作用有补气固表、利尿、托毒排脓、生肌等疗效，主治气短、虚脱、心悸、自汗、体虚浮肿、慢性肾炎、脱水、久泻、气虚、气血不足、中气下陷，有抗菌消炎、降压利尿、解毒利胆等功效，是一种常用中草药。

随着人们日益增长的保健观念的强化，黄芪的需求量将会逐年增加，但目前黄芪的野生资源逐年减少，栽培品种下降且面临农药污染和重金属残留等问题的困扰。因此应用现代生物技术提高黄芪的产量，改善其品质，探索工业化生产的可行途径对黄芪的生产具有重要意义，黄芪甲苷是中国药典规定的含测指标，如果能寻找到提高黄芪甲苷含量的人工黄芪产品，将具有良好的开发和应用前景。

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)对植物的侵染是自然界中天然的遗传转化模式，它通过所含有的致根质粒(Ri)的一部分(T-DNA)在植物基因组中的整合和表达,导致毛状根的产生。毛状根具有生长快速、多分支、无向地性和激素自养的特点，而且毛状根的生理生化、遗传性能稳定。毛状根同时还保持了植物正常根的某些生化功能，能够高效生产次生代谢产物，特别适用于替代植物根部有效成分的生产。自从1997年Ackermann第一次利用发根农杆菌成功转化高等植物以来，至今已建立了超过100种植物毛状根的培养系统，其中有不少是药用植物。例如黄花烟草、曼陀罗、颠茄、莨菪、长春花、紫草、辣根的毛状根小规模培养已经成功。利用毛状根培养技术大规模生产药用植物的有效次生代谢产物呈现出十分诱人的前景，同时对于保护野生资源与生态环境，实现可持续发展也具有积极的意义。而用发根农杆菌Ri质粒诱导蒙古黄芪建立发根培养的无性繁殖体系,可以为资源的开发利用研究提供一条可行的新途径。

发明内容

本发明的目的是克服黄芪毛状根中有效成分含量不同、品质不一的不足，同时利用生物技术来保护我们珍贵的土壤资源，提供一种工业化大规模生产黄芪毛状根的方法，可在保证黄芪甲苷含量的基础上，稳定地高产黄芪毛状根。

为了实现上述目的，本发明提供一种大规模生产黄芪毛状根的方法，包括以下步骤：

步骤1.制备黄芪无菌苗

将黄芪种子用自来水浸泡20-24h后，放入70％乙醇中浸泡1-3min，用无菌水冲洗3-5遍；倒入1％升汞溶液浸泡8-10min；用无菌水冲洗5-10遍；接种至提前灭菌的MS培养基上，温度25-30℃，湿度50-60％培养，获得黄芪无菌苗；

步骤2.菌种活化和培养

将农杆菌加入到液体YEB培养基中于26-28℃，220-250rpm下培养至OD600值为0.5-0.6；然后，将菌液在1/2MS液体培养基中进行培养，于26-28℃下150-180rpm培养20-30min；

步骤3.材料预培养和共培养

将无菌苗的叶，茎，下胚轴、叶柄转接至添加植物激素的MS培养基上，避光培养1-2天，诱导愈伤组织；然后，再与步骤2中的菌液充分接触，于50-60rpm，25-28℃下共培养30-40min；

步骤4.除菌

将步骤3的愈伤组织加入到含500mg/L的头孢噻肟钠(cef)的1/2MS固体培养基上，于25℃下避光培养；并间隔一周更换新的培养基，同时逐渐降低头孢噻肟钠(cef)的浓度；