[发明专利]一种提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法

权利要求书

1.一种提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法，其特征在于：步骤如下：

⑴成虾养殖水的制备：由于罗氏沼虾为淡水虾，所以普通的罗氏沼成虾只需将用消过毒的水曝气三天以上即可放入成虾饲养；

⑵亲虾饲料的配制：其组成成分及重量份数如下：

海藻粉10-15份，小球藻10-15份，虾粉10-15份，鱼粉10-15份，益生菌5-10份，甲壳素1-2份，复合矿物质1-2份，复合维生素1-2份，小麦粉10-15份，菠菜10-15份，发酵玉米蛋白10-20份，将各原料混匀即得；

⑶罗氏沼虾亲虾的养殖：将成虾按每m³/10尾的数量放置在养殖缸中，用步骤⑴配制的养殖水养殖，用步骤⑵配制的亲虾饲料喂养成虾，待母虾抱卵；

⑷洗卵液的制备：在无菌环境下，将中性蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶以质量比1：1.5：1.2比例混合，然后加水配成质量浓度为1％的水溶液，即得洗卵液，洗卵液在4℃冰箱下保存；

⑸胚胎的离体方法：用洗卵液润湿干净的脱脂棉，将润湿的脱脂棉放在抱卵不超过10小时的现有亲虾需要脱卵的部位，停留1分钟，用孵化水将亲虾身上的卵冲下，低浓度高锰酸钾溶液消毒10秒，4℃环境下保存备用，整个过程中使用到的器材均消毒灭菌；

⑹孵化的方式：将保存的受精卵拿出，在体视镜下观察细胞正处于的时期，拍照记录；将配好的低浓度高锰酸钾溶液倒入已灭菌的玻璃皿中，将准备孵化的受精卵放入玻璃皿的低浓度高锰酸钾溶液中静置10～15秒，然后用已消毒的塑料吸管将卵全部吸出，放入已经消过毒的容器中，倒入配制好的孵化水，孵化水的添加量按5-10ml/卵的数量缓缓加入，在室温25±1℃下孵化24h后重新消毒换水并定时剔除坏卵即可；

所述步骤⑸中孵化水的制备步骤如下：

准确量取盐度为10‰的过滤海水，灭菌，取出，冷却至室温；分别准确称取EDTA、PBS缓冲液、DMEM，倒入灭菌后海水中，每1L灭菌后海水中加入5g EDTA、3ml PBS缓冲液、2g DMEM，0.22μm滤膜过滤灭菌，即得孵化水；密封保存，并放置室温下备用；

每1LPBS缓冲液的制备如下：

称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml过滤海水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加过滤海水定容至1L；

所述低浓度高锰酸钾溶液的配制步骤如下：

称取高锰酸钾试剂，然后加入蒸馏水，每1L蒸馏水中加入0.1mg高锰酸钾试剂，混匀，密封保存，即为配置好的低浓度高锰酸钾溶液。

2.根据权利要求1所述的提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法，其特征在于：所述灭菌为放入高温高压灭菌锅内灭菌2h。

3.根据权利要求1所述的提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法，其特征在于：步骤⑸中配置好的孵化水使用期限不超过一个月。