[发明专利]一种RANKL重组蛋白表达载体的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种RANKL重组蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下过程：(1)体外分子克隆技术，获得小鼠RANKL基因全长；(2)通过测序，明确已获得克隆序列与数据库中的序列完全一致；进一步通过基因重组技术将小鼠RANKL基因重组于pET-32a表达载体中，成功构建RANKL重组蛋白表达载体。

2.根据权利要求1所述的一种RANKL重组蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中体外分子克隆技术，获得小鼠RANKL基因全长，具体包括以下过程：

(1-1)小鼠头盖骨样本RNA提取及RT-PCR；

(1-1-1)分离出生后1-3天内的小鼠头盖骨组织，通过TRIZOL进行组织RNA的提取；将分离到的头盖骨组织转移至1.5ml RNase-free EP管中，加入1ml Trizol裂解液，使用匀浆器将制成组织悬液后置于冰上裂解10min；

(1-1-2)加入200μl三氯甲烷，置于涡旋仪剧烈振荡15s，室温静置5min后12000rpm离心15min；离心温度均为4℃；

(1-1-3)小心取出离心管，此时可见管内液体分为3层，小心吸取无色上清至新EP管中，再加入异丙醇500μl，上下轻柔颠倒混匀，静置10min后12000rpm离心10min；

(1-1-4)弃去上清，用1ml 75％乙醇将RNA沉淀清洗一遍，12000rpm离心5min；

(1-1-5)弃去上清，静置待剩余酒精挥发；

(1-1-6)用RNase-free水溶解RNA；测定并记录RNA的浓度与OD值，做好标记储存在-80℃中；

(1-2)RNA逆转录合成cDNA：使用Takara RR047A逆转录试剂盒进行RT-PCR反应，将500ng RNA逆转成cDNA；

(1-2-1)去除基因组体系如下：

(1-2-2)冰上配制并混和去基因组体系各组分后，于PCR仪上42℃2min，4℃放置；逆转录体系如下：

(1-2-3)冰上配制好逆转反应体系；再混匀去基因组体系，于PCR仪上37℃30min，85℃5s，4℃∞，最终得到的产物用RNase-free水稀释10倍作为RT-PCR反应模板备用；

(1-2-4)设计引物克隆mRNAKL基因

上游引物：NcoI-CCATGG–CTCCAGCTATGATGGAAGGCTC；

下游引物：XhoI-CTCGAG–TCAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG；

冰上配制好PCR反应体系如下：

(1-2-5)PCR反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分理处目的片段，目的片段大小应该在525bp范围；通过胶回收试剂盒回收扩增出的产物片段；

(1-2-6)产物进行末尾加A反应，反应体系如下：

加A产物与T载体连接，反应体系如下：

(1-2-7)连接产物进行转化：

(1-2-7-1)取10ul上述连接好的质粒，按照9:1加入solution III，轻轻混匀后，加入100ul DH5a感受态细胞中，轻轻谈匀，4℃冰浴30min，42℃热激90s，4℃冰浴5min，加入450ul LB培养基，150rpm，37℃,45min；同时，制备蓝白斑筛选平板，取10ul IPTG，40ul X-gal及30ul Amp均匀涂布与LB固体平板上备用；

(1-2-7-2)摇菌结束后3000rpm离心5min，弃上清，重悬于100ul LB培养基中，均匀涂布于含有Amp+(30ul)，IPTG(10ul)及X-gal(40ul)平板中，37℃过夜培养；

(1-2-7-3)通过蓝白斑筛选，挑取白色单克隆菌落进行摇菌扩增后送测序。