[发明专利]一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统及方法

说明书

本发明公开了一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统及方法。根据终止子终止转录和保护上游基因mRNA的功能，设置了特征参数转录终止程度(α)、上游基因mRNA保护能力(β)和表观终止效率(η)。本发明还公开了表征上述终止子特征参数所用的探针质粒的构建方法及其应用。本发明中构建的终止子探针质粒为pTK、pTK‑dR和pTK‑sR，分别对应特征参数为α、β和η，为全面表征大肠杆菌终止子强度提供了有效工具，进而为合成生物学提供了精准的元件模块。

技术领域

本发明涉及一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统及方法，属于合成生物学技术领域。

背景技术

基因转录是指将RNA聚合酶(RNAP)招募至启动子后开始mRNA合成，当遇到终止子时解离并重复循环的一个过程。终止子是优化代谢途径和基因工程中的重要调控元件，不仅可以调节基因转录速率，还可以调节mRNA降解速率，从而调控蛋白的初始表达量。

终止子可以分为内源性终止子和ρ因子依赖型终止子。大肠杆菌中有大约80％的转录终止是由于内源性终止子的作用，并且相比较于ρ因子依赖型终止子，内源性终止子的结构和作用机制都更加的简单明确。内源性终止子位于基因的3＇-UTR区，表现为一个带有U-tract的发夹结构。终止子最短约20nts，最长为30多nts，其中发夹结构的茎长为5～9bp，环为3～5nts，U-tract为7～9nts。在转录过程中，当RNAP转录至终止子的U-tract时，转录速率会下降甚至出现暂停，此时终止子的发夹结构形成，从而使得RNAP解离并终止基因转录。在构建完整的基因回路时，终止子能及时有效地终止基因转录从而保证转录单元之间互不干扰，因此是一种必不可少的元件。另外，根据终止子终止转录程度的差异，可以将其用于重要中间代谢物的表达调控。例如在L-鸟氨酸的生产中通常采用敲除arg F基因的方法来提高产量，但却会导致生产成本的增加，并且影响菌体生长。Zhang等通过在arg F基因前插入终止子，在不影响菌体生长的前提下提高了鸟氨酸的产量。终止子除了能够单独用于基因调控，还可以和其它元件组合成用途多样的智能开关。比如将重组酶识别位点与终止子组合成逻辑门用来调控细胞的状态；将可以根据温度变化改变结构的RNA改造成终止子，成为温敏型的智能开关；还可以将终止子和适配体组合成核糖开关等。

为了能在构建基因回路时准确使用终止子，以及理性设计与终止子相关的智能开关，构建终止子文库并对终止子进行精确表征十分重要。Kingsford等用一种快速准确的计算机程序预测了343种原核生物基因组中的内源性终止子。Chen等构建了一个含有582个大肠杆菌终止子的基因文库并对其中的终止子强度进行了表征。Cambray等利用RNA水解酶位点构建了终止子表征模型，消除了在表征过程中由终止子本身所引起的误差。但是，已有的研究对终止子的表征都不够全面，影响终止子调控基因表达的使用。H Abe和H Aiba认为终止子除了能够终止基因转录这一基本作用外，其发夹结构和U-tract还可以保护上游基因转录物的稳定性。因此，在对终止子进行表征时，应考虑终止基因转录和对上游基因mRNA保护性两方面的因素。对终止子强度进行全面且精确的表征能让终止子在基因工程中发挥更大的作用。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一个全面表征终止子强度的方法。

本发明所要解决的另一个技术问题在于，提供了上述表征方法所使用的终止子探针质粒的构建方法。

本发明所要解决的最后一个技术问题在于，提供了上述终止子探针质粒的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统，由三个探针质粒pTK、pTK-dR和pTK-sR组成；

其中，所述的探针质粒pTK以SEQ ID NO.4所示的质粒pK为骨架质粒，将探针单元1克隆到骨架质粒中，所述的探针单元1在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS1，并用诱导型启动子诱导基因表达；