[发明专利]病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途

说明书

本发明涉及病毒核酸检测领域。具体地，本发明提供了一种用于病毒核酸检测的预处理方法，所述方法包括将含有样本的预处理液与核酸释放剂和qPCR扩增试剂混合，其中，所述预处理液包括：Tris‑HCl、EDTA‑2Na、氯化钠、核糖核酸酶抑制剂和抗生素；其中，所述预处理液的pH为6.5~8.0。使用本发明的方法配置的核酸检测反应液，能够直接进行qPCR，提高检测效率，缩短检测时间。

技术领域

本发明涉及病毒样本的核酸检测领域；特别地，涉及一种病毒样本预处理方法和预处理液，用于对DNA/RNA病毒进行预处理。

背景技术

现行传统的病毒预处理液主要有两种方式：基于Hank's基质的预处理液和基于胍盐的预处理液。Hank's液是病毒运送的常见的平衡盐溶液（Balanced Salt Solution，BSS）。受各种因素的影响，Hank's液保存呼吸道病毒（如流感病毒、新冠病毒等）只能保存数个小时，数个小时之后病毒形态就会受到影响，进而会影响到病毒的核酸检测效率，如果时间再延长一些，那么还很容易滋生细菌、真菌，导致Hank's液pH值下降，加速病毒降解，所以很难用于病毒的长期保存与核酸检测。而基于胍盐的病毒预处理液中的盐酸胍或者Rnasin的浓度相对而言较高（3-5M），高浓度的胍盐适用于常温下的病毒灭活。但是由于胍盐浓度太高，对于诸如磁珠法的核酸提取或纯化有很大的抑制作用，需要多次洗涤或者用于离心柱的方式才可进行。

样本免提取的核酸释放及扩增技术（Extraction Free Nucleic Acid Releaseand Amplification Technology，EFNART）,简称“一步法”技术，是指在不需要对样本进行核酸提取或纯化的情况下，直接搭配强碱性质下的样本核酸释放剂和高兼容性的扩增体系，进行直接的样本核酸扩增检测。这样的“一步法”操作将大大节省病毒核酸检测尤其是RNA病毒的检测时间，预计相比较传统的核酸提取后的扩增方法，该发明可以节省60%以上的时间，检测效率提升50%。

在发生重大疫情（例如，2019-2020年发生的新冠2019-nCoV疫情）的时候，更加倾向于一步法检测，可以节省检测时间，提高效率，会对整个疫情的攻克带来巨大的贡献。

但是，现行常见的病毒预处理液，例如Hank's和基于胍盐的预处理液均不能很好的用于后续的一步法检测，从而很难用于病毒样本的快速检测和筛查的应用场景中。

因此，本领域需求一种能够很好适配于基于一步法的病毒核酸检测的样本预处理液。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供一种用于病毒核酸检测的预处理方法，所述方法包括将存放在预处理液中的样本与核酸释放剂和qPCR扩增试剂混合，

其中，所述预处理液包括：Tris-HCl、EDTA-2Na、氯化钠、核糖核酸酶抑制剂和抗生素；

其中，所述预处理液的pH为6.5~8.0。

在本发明中，Tris-HCl可以约10~约200mM的浓度存在，优选以约80~约120mM的浓度存在，最优选以约100mM的浓度存在。

在本发明中，EDTA-2Na可以约8~约50mM的浓度存在，优选以约10~约15mM的浓度存在，最优选以约10mM的浓度存在。

在本发明中，氯化钠可以约0.5%~约2%（w/v）的浓度存在，优选以约0.8~约1%（w/v）的浓度存在，最优选以约0.9%（w/v）的浓度存在。

在本发明中，“核糖核酸酶抑制剂”是指能够对核糖核酸酶进行抑制，使其失活的化学物质。包括但不限于焦碳酸二乙酯（DEPC）、RNA酶的蛋白质抑制剂（RNasin）、氧钒核糖核苷复合物、SDS等。