[发明专利]一种用于犬瘟热病毒基因检测的引物、探针及检测试剂盒

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于犬瘟热病毒基因检测的引物、探针及检测试剂盒；所述检测犬瘟热病毒的引物包括有：环茎型反转录引物、在环茎型反转录引物序列上设计的上游引物及探针；与现有技术相比降低了不同基因型RNA病毒检测的引物探针设计难度，应用本发明方法使用一套引物探针系统检测6个基因型犬瘟热病毒；极大地降低了设计难度，与目前常用的多重PCR相比，降低引物和探针间影响因素，降低检测成本，最大限度保证诊断能力，方便临床使用。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于犬瘟热病毒基因检测的引物、探针及检测试剂盒。

背景技术

反转录PCR(RT-PCR)是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被反转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于RNA病毒检测、遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。

犬瘟热病毒是感染犬的一种最古老的、临床意义最大的病毒。感染的自然宿主为犬科动物和鼬科动物，主要通过空气和飞沫水平传播。病犬是重要的传染源，并通过尿液长期排毒，污染周围环境；不同年龄、性别和品种的犬均可感染，病犬是最重要的传染源，通过尿液长期排毒，污染周围环境。感染CDV表现症状多种多样，主要可分为超急性型、急性型、消化道症状、神经症状和皮肤症状5种特征性类型，一旦出现特征性症状，则预后极差。CDV感染病型复杂多样，临床上诊断很困难，易与上呼吸道感染、犬传染性肝炎、犬冠状病毒感染等相混淆，随着宠物数量的增加，犬瘟热病毒检测试剂的需求也越来越大，对犬瘟热病毒核酸检测试剂的特异性和敏感性也提出了更高的要求。

犬瘟热病毒(caninedistempervirus，CDV)在分类上属副黏病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)，是一种单链RNA病毒，单链RNA结构不稳定，同时RNA聚合酶无3′-5′端修正活性，繁殖过程中很容易出现变异，目前分为6个基因型，不同基因型同源性差异大，在同一基因型不同毒株间同源性差异也较大，设计通用型引物和探针困难，目前常规试剂盒采用设计多个引物及探针或兼并碱基方法，其特异性和敏感性较差，容易出现漏诊及误诊。

发明内容

针对现有技术检测犬瘟热病毒基因容易出现漏诊、犬瘟热病毒检测试剂-包括核酸检测试剂敏感性较差的问题，本发明的目的在于提供一种用于犬瘟热病毒基因检测的引物、探针及检测试剂盒从而解决犬瘟热病毒基因突变频率高，尤其涉及不受犬瘟热病毒基因型影响，提高特异性和敏感性的检测犬瘟热病毒的引物、探针及试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种逆转录用环茎型引物，不同基因型只需很短的特异性保守序列，就能设计引物探针，降低引物探针设计难度，提高敏感性，减少漏诊率。

第二方面，本发明提供一种提高反转录核酸链式扩增特异性和敏感性的RT-PCR反应液，反应液添加反转录酶、taq酶、dNTP、特异性引物、缓冲液等常规成分以外，还添加了recA蛋白以及为recA蛋白提供能量的ATP。

第三方面，本发明提供一种检测犬瘟热病毒的试剂盒，包括引物对、荧光探针选择、配制RT-PCR反应体系、设置反应条件的步骤，其中，所述引物对采用上述的引物对，所述荧光探针采用上述的荧光探针。

在其中一个实施例中，所述设置反应条件的步骤中，反转录反应温度设为42-50℃，反应温度设为50-62℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：