[发明专利]一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法及其应用

权利要求书

1.一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于包括如下步骤：

S1，血浆外泌体提取:从-80℃取出血浆放在4℃温度中溶化,然后取出250μl血浆于无菌离心管，离心去除细胞和细胞碎片,转移上清液于无菌离心管中，加入63μl外泌体沉淀剂进行混匀，放置于4℃温度里30min，然后离心至外泌体为圆饼状贴在管底，吸去上清液，然后将剩余的液体重新1500×g离心5min，吸去瓶里所有液体，不要碰到瓶底的外泌体；

S2，酶联免疫吸附实验：在从血浆提取出来的外泌体中加入300μlRIPA蛋白裂解液和3μlcocktail蛋白抑制剂，然后涡旋使沉淀重悬于溶液中，将溶液置于-80℃的温度5min，25℃水浴锅5min，如此重复3个循环，将溶液存放于-80℃的温度中，在需要的时候拿出来在4℃下进行溶化，采用酶联生物的人β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)/人Tau蛋白(Tau)/人磷酸化tau(Ps396-tau)酶联吸附免疫实验试剂盒，分别检测Aβ1-42、Tau、Ps396-tau，严格按照说明书进行实验，从试剂盒中的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃冰箱，设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔中加入待测样本50μL，空白孔不加，除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃温育60min，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满试剂盒提供的洗涤缓冲液350μL，静置1min，甩去洗涤缓冲液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次，每孔加入50μL试剂盒中的底物A和B，37℃避光孵育15min，每孔加入试剂盒提供的终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；

S3，拍摄电镜照片：将外泌体沉淀重悬于30μLPBS中，然后取出10μL并在90μLPBS中稀释，将3μL滴于电子显微镜中带有碳膜的铜网上，1分钟后，吸去多余的液体并滴入一滴磷钨酸染料溶液，1分钟后，再次吸走多余的液体，使样品风干，将完全干燥的铜网安装在Philips-FEI TecnaiTlO的TEM下，然后拍照；

S4，NTA实验：将源自血浆的外泌体沉淀重悬于300uL PBS中，将所得混合物稀释100倍上机，NanoSight LM10使用精细聚焦的激光束通过玻璃棱镜引入稀释100倍的样品中；

每个样本运行3次，每次捕获两个60s视频图像，每个实验中的所有分析设置都保持不变，从NTA获得的尺寸分布曲线，在视频重复中对每个样本取平均值，然后在样本之间取平均值以确定代表性的尺寸分布曲线。

2.根据权利要求1所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述步骤S1中的上清液转移、吸去和吸去瓶里所有液体均是通过移液枪实现的。

3.根据权利要求2所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述去除细胞和细胞碎片的离心条件为3000×g速度下离心15min。

4.根据权利要求1所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述外泌体沉淀剂为ExoQuickTM SBI外泌体沉淀剂。

5.根据权利要求4所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述加入63μl外泌体沉淀剂进行混匀的方法为将无菌管进行颠倒和轻弹无菌管管壁。

6.根据权利要求3所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述步骤S1中的4℃温度和步骤S2中-80℃温度均是通过恒温冰箱实现的。

7.根据权利要求2所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述血浆外泌体的样本来源于医院，所述血浆外泌体的样本数量为16个，所述16个样本包括8个来源于神经内科门诊的病人样本和8个来源于体检中心的健康对照样本，所述16个样本的参与者均进行神经心理评估和APOE分型测试。