[发明专利]用于检测马流产沙门氏菌抗体的间接ELISA试剂盒及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于检测马流产沙门氏菌抗体的间接ELISA试剂盒及其制备方法和应用。所述的试剂盒中包含马流产沙门氏菌FljB蛋白包被的酶标板，其中，所述的马流产沙门氏菌FljB蛋白由SEQ ID NO.2所示的序列编码。本发明通过序列分析后，以P3/P4扩增马流产沙门氏菌特异性序列，并将其克隆至原核表达载体pET‑28a，构建重组表达质粒pET28a‑FljB，转化入Rosetta(DE3)，用IPTG进行诱导表达，以纯化后的FljB蛋白作为包被抗原，建立马流产沙门氏菌抗体的间接ELISA方法，结果显示，以该蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法，具有良好的特异性、敏感性、重复性，可以用于临床马流产沙门氏菌抗体的检测。

技术领域

本发明涉及一种间接ELISA试剂盒及其制备方法和应用，特别涉及一种用于检测马流产沙门氏菌抗体的间接ELISA试剂盒及其制备方法和应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

马流产沙门氏菌病(Equine abortus Salmonellosis)是由沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.typi)等引起的一种以孕马流产为主要特征的马属动物传染病，又名为马副伤寒(Equi parathphoid)或马沙门氏菌性流产。该病易感染初产母畜，多数母畜在发生流产前，一般无明显临床症状，突发流产，绝大多数为死胎，有少数存活的胎儿，在出生几天后，也会发生死亡。妊娠母马流产时，病菌随流产胎儿、胎衣、羊水及阴道分泌物排出体外,病公马(驴)能随精液排菌。

近年来，该病在我国华东、华北和西北等地区爆发流行，主要引起马、驴的流产，流产率为30-100％。前期实验室研究，将流产马驹胎儿脏器组织进行细菌的分离鉴定，结果均为马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi,S.abortus.equi)，但该病在国内、外的研究较少，缺乏特异性的检测技术，我国《马流产沙门氏菌病诊断技术(NY/T 570-2002)》行业标准(行标)中提及该病的血清学检测方法为试管凝集试验(TAT)，该方法可用于检测马流产沙门氏菌，但在个别情况下，也可能检出沙门氏菌的其他血清型，比如鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,S.enteritidis)、都柏林沙门氏菌(Salmonelladublin，S.dublin)等沙门氏菌的抗体，需要进一步根据细菌抗原构造予以鉴别，因此特异性不强；由于试验结果依赖于肉眼观察细菌与抗体的凝集程度，因此敏感性不高；需要有经验的人员操作；而且操作繁琐、耗时费力；采用试管进行操作、样品又需要多个稀释度，无法满足大规模样品检测的需要。所以，为了应对疫情的连年爆发，亟需建立一种特异性强、敏感性高和高通量的检测方法。

沙门氏菌的鞭毛蛋白成分主要是蛋白质，鞭毛抗原中含有不同的H抗原，分为I型和II型，即FliC和FljB蛋白，每个鞭毛都由基体、弯钩和细丝三个亚单位组成，结构极其复杂，具有良好的收缩性，抗原性，但是不稳定，一旦遇到酒精或者受到高温，其结构则会被破坏。鞭毛也是沙门氏菌的主要毒力因子，沙门氏菌鞭毛与在体外的定值以及侵袭细胞的能力有关，缺失后，导致在体内生存能力减弱，致病力减弱。两种蛋白的结构比较相似，蛋白两端氨基酸序列高度同源，中间氨基酸序列差异大，称为可变区，可变区中不同的碱基序列编码不同的氨基酸序列，形成不同的抗原表位，具有特异性，也被称为抗原决定区。马流产沙门氏菌属于单相沙门氏菌，只表达II相鞭毛蛋白FljB，而不表达I相鞭毛蛋白FliC。

因此本发明选取鞭毛蛋白FljB为研究对象，对不同菌株的FljB全基因进行扩增和序列分析，并与Genbank登录的其他沙门氏菌进行同源性分析，选取马流产沙门氏菌特异性序列进行原核表达，旨在建立一种马流产沙门氏菌特异性的血清学检测方法，为该病的检测和防控奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测马流产沙门氏菌抗体的间接ELISA试剂盒及其制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：