[发明专利]定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。所述试剂盒含有包被有3ABC多抗的化学发光板、酶标单抗、抗原标准品、破乳剂、血清稀释液、20×PBST洗涤液、化学发光液；所述的包被有3ABC多抗的化学发光板为白色可拆卸的聚苯乙烯96孔板；所述酶标单抗为识别3B蛋白的酶标单抗9E2‑HRP；所述抗原标准品为含有10 ng/ml的3ABC，质量分数为0.2%的BSA和体积分数为0.05% prolin300；所述的破乳剂为正戊醇或正丁醇。本发明所述的试剂盒灵敏度高，能够对口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白进行快速定量。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体，涉及定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒及其检测方法。

背景技术

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的，以感染猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触传染性动物疫病。FMDV是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，基因组大小为8400bp，编码4种结构蛋白(SPs：VP4，VP2，VP3和VP1)和8种非结构蛋白(NSPs：L，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D)，以及存在一些未裂解的前体，如3ABC。我国口蹄疫防控主要采取疫苗免疫、扑杀感染和可疑动物以及血清监测的综合性防控措施来控制口蹄疫的流行。理论上来说只有感染FMDV的动物，体内才存在NSPs抗体，而免疫动物体内不存在NSPs抗体。所以区分口蹄疫感染与免疫主要依赖于检测NSPs抗体。但由于抗原纯化工艺的问题，灭活疫苗抗原中仍会残留少量的NSPs。因此在疫苗免疫地区进行NSPs检测时，NSPs抗体不仅能在口蹄疫感染动物中检测到，而且也能在一些多次疫苗免疫的动物体内检测到。但国内目前还没有一种能够定量检测口蹄疫灭活疫苗中NSPs的方法，因此急需一种定量检测方法来评价口蹄疫灭活疫苗中NSPs的残留。

为了控制口蹄疫的传播，世界动物卫生组织(OIE)规定在口蹄疫发生国家或疫苗免疫国家要想恢复口蹄疫无疫状态，必须通过检测动物体内无口蹄疫NSPs抗体来证明该国无口蹄疫循环。因此OIE对口蹄疫灭活疫苗的纯净度制定了准则，该准则需要口蹄疫生产厂家证明疫苗中缺乏NSPs的免疫原性，并推荐评价疫苗纯净度的方法。该评价方法具体是：至少用8头牛免疫两次，首免后21-30天后进行第二次免疫，第二次免疫后的30-60天检测牛体内非结构蛋白抗体。其中有一头检测为NSPs抗体阳性是可以接受的；若超过两头检测为NSPs抗体阳性，则这批疫苗是不合格；若两头检测为NSPs抗体阳性，厂家有权要求进行复检。然而，动物实验即费钱又费时，如果有一批疫苗不能满足纯度要求，厂家必须将整批苗弃掉。目前国内口蹄疫灭活疫苗的保存期多为1年，仅这一项NSPs残留评价就需2-3月，这给生产厂家带来很大负担。因此目前亟待一种定量检测口蹄疫灭活疫苗中NSPs的试剂盒，为口蹄疫生产厂家和第三方检测机构对成品疫苗中NSPs含量进行检查，并获得疫苗中NSPs含量的证明。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供定量检测口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒，目的二在于提供利用所述化学发光试剂盒进行口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白残留的定量检测方法。本发明通过从众多破乳方法中筛选出能够用于免疫学检测的最佳破乳方法，并利用这些最佳破乳方法建立一种能够定量检测口蹄疫灭活疫苗中NSPs残留的化学发光法。该方法灵敏度高，能够对口蹄疫灭活疫苗中非结构蛋白进行快速定量。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

定量检测口蹄疫灭活疫苗中NSPs残留的化学发光试剂盒，包括包被有3ABC多抗的化学发光板、酶标单抗、抗原标准品、破乳剂、血清稀释液、20×PBST洗涤液、化学发光液；

所述酶标抗体为偶联HRP的识别3B蛋白的单抗；

所述抗原标准品中含有10ng/ml的3ABC，质量分数为0.2％的BSA和体积分数为0.05％prolin300；

所述破乳剂为正戊醇或正丁醇；