[发明专利]一种基因组整合外源序列的方法

权利要求书

1.一种适用于罗氏真氧菌的基于位点特异性重组酶的基因插入方法，包括以下步骤：

1）在罗氏真养菌的基因组上插入位点特异性重组酶Bxb1对应的attB位点以构建基因组上整合了attB序列的重组罗氏真氧菌，其中，所述罗氏真氧菌为Ralstonia eutrophaH16；

2）构建含有外源序列、位点特异性重组酶Bxb1基因、位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列的重组载体，所述重组载体为无法在罗氏真氧菌中复制的质粒载体，并且所述重组载体的骨架部分包含能在大肠杆菌S17-1中复制而不能在罗氏真氧菌中复制的复制子pMB1，以及所述重组载体的骨架部分还包含筛选标记基因，所述筛选标记基因为抗生素抗性基因；

3）将步骤2）中构建的所述重组载体转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入步骤1）中构建的所述重组罗氏真氧菌中，利用所述位点特异性重组酶Bxb1介导attB和attP序列之间的重组，从而将所述重组载体整合到所述重组罗氏真氧菌的基因组上，

其中，步骤1）中，所述位点特异性重组酶Bxb1对应的attB位点的序列如SEQ ID NO: 10所示；步骤2）中，所述位点特异性重组酶Bxb1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示，所述位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列如SEQ ID NO: 22所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2）中，所述抗生素抗性基因选自卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因中的一种或多种。

3. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2）中，所述位点特异性重组酶Bxb1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 20所示。

4.一种适用于罗氏真氧菌的基于位点特异性重组酶的基因插入方法，包括以下步骤：

a）在罗氏真养菌的基因组上插入位点特异性重组酶Bxb1对应的attB位点以构建基因组上整合了attB序列的重组罗氏真氧菌，其中，所述罗氏真氧菌为Ralstonia eutrophaH16；

b）构建含有氨基酸序列如SEQ ID NO: 43所示的VCre重组酶基因的重组载体，该步骤中的重组载体为能在罗氏真氧菌中复制的质粒载体，并且所述重组载体的骨架部分包含既能在大肠杆菌S17-1中复制也能在罗氏真氧菌中复制的复制子pBBR1，以及该步骤中的重组载体的骨架部分还包含筛选标记基因，所述筛选标记基因为抗生素抗性基因；

c）构建含有外源序列、位点特异性重组酶Bxb1基因、位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列、2个能够被步骤b）中的VCre重组酶特异性识别的VloxP序列的重组载体，其中，所述外源序列和所述attP序列在所述2个VloxP序列之间，所述位点特异性重组酶Bxb1基因不在所述2个VloxP序列之间，该步骤中的重组载体为无法在罗氏真氧菌中复制的质粒载体，并且该步骤中的重组载体的骨架部分包含能在大肠杆菌S17-1中复制而不能在罗氏真氧菌中复制的复制子pMB1，以及该步骤中的重组载体的骨架部分还包含筛选标记基因，所述筛选标记基因为抗生素抗性基因；

d）将步骤c）中构建的所述重组载体转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入步骤a）中构建的所述重组罗氏真氧菌中，利用所述位点特异性重组酶Bxb1介导attB和attP序列之间的重组，从而将步骤c）的所述重组载体整合到所述重组罗氏真氧菌的基因组上；

e）将步骤b）中构建的所述重组载体转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入步骤d）得到的基因组上整合了步骤c）所述重组载体的重组罗氏真氧菌中，从而将步骤c）所述重组载体的骨架部分从重组罗氏真氧菌的基因组上删除，

其中，步骤a）中，所述位点特异性重组酶Bxb1对应的attB位点的序列如SEQ ID NO: 10所示；步骤c）中，所述位点特异性重组酶Bxb1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示，所述位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列如SEQ ID NO: 22所示，以及所述VloxP序列如SEQ ID NO: 45所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤b）中，所述抗生素抗性基因选自卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因中的一种或多种。