[发明专利]一种滚环复制重组载体、构建方法及应用

权利要求书

1.一种滚环复制重组载体，其特征在于，所述的载体为pCambia0390-SPLCV ^mAC24-mid，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15。

2.如权利要求1所述的滚环复制重组载体构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下方案：

步骤1：获得SPLCV基因序列；

将带有甘薯卷叶病毒表型的植株，通过液氮急冻研磨后利用CTAB法提取DNA，并利用该病毒的保守引物进行PCR引物扩增获得对应PCR产物；

步骤2：扩增获得SPLCV复制子蛋白相关基因序列SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR和SPLCV-IL；

基于步骤1所获得SPLCV基因序列设计引物扩增得SPLCV复制子蛋白相关基因序列SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR和SPLCV-IL；其中，SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR的尾端序列命名为T-SPLCV-XZ-nIR，其具体序列为：T-SPLCV-XZ-nIR(SEQ ID NO：6)，在本方法构建的重组载体设计中作为终止子参与病毒复制蛋白的转录终止；

步骤3：构建定点突变载体T-mAC4；

对于AC4蛋白的提前终止定点突变方案为：将SPLCV基因组第183处碱基由T突变至A，对应AC1氨基酸保持为异亮氨酸不变，对于AC4的氨基酸由苯丙氨酸变为终止子从而打断AC4蛋白的翻译；

步骤4：构建突变载体T-mAC2mAC4；

在步骤3获得的T-mAC4质粒基础上进行AC2突变，对于AC2蛋白的提前终止定点突变方案为：在SPLCV AC4核苷酸第1034bp处碱基由A突变至T，对应AC1氨基酸由谷氨酸突变至缬氨酸，对于AC2的氨基酸由异亮氨酸突变为终止子从而打断AC2蛋白的翻译；

步骤5：构建双定点突变重组载体pCambia0390-SPLCV ^mAC24-mid；

利用引物组合pCa-SPLCV UTR 1F/pCa-SPLCV UTR 1R对步骤4所得载体T-mAC2mAC4进行扩增，将PCR扩增获得的PCR产物纯化以及步骤2所得SPLCV-IL纯化产物利用同源重组技术连接预先利用HindIII/BamHI酶切后的pCambia0390上，转化大肠杆菌DH5a，并筛选阳性克隆后，摇菌提取对应质粒；对应质粒命名为pCambia0390-SPLCV ^mAC24-mid。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤2的2对带接头引物为：

pCa-SPLCV IL 1F:atgttgggcccggcgcgccatttgctgacgtatgcaatgggt(SEQ ID NO：7)

pCa-SPLCV IL 1R:ggggatcCtgcagccaagcttcttggcggccaagactggaa(SEQ ID NO：8)

pCa-SPLCV UTR 1F:aagaggagtccacCATGGTAtaaaatttgtttttattaatacagtaatac(SEQID NO：9)

pCa-SPLCV UTR 1R:agcgttaacactagtcagatctcttggcggccaagactggaaca(SEQ IDNO：10)。