[发明专利]PD-L1纳米抗体、制备方法及其应用

说明书

本发明属于抗体技术领域，公开了一种PD‑L1纳米抗体、制备方法及其应用，设计合成引物2条，通过PCR的方法扩增出足够量的目的产物换载酶切，目的片段与载体连接，转化，筛选克隆；蛋白鉴定表达；构建抗体库；选用M13噬菌体展示系统展示VHH抗体文库，该系统由pMECS噬菌粒载体、E.coli TG1和M13KO7辅助噬菌体组成。本发明在噬菌粒载体pMECS中，Pst I酶切位点之前的序列为pelB分泌信号肽和抗体第一个框架区部分氨基酸的编码序列，pelB信号肽能够将后续多肽引导分泌至周质腔；Not I酶切位点之后是HA和6×His标签的编码序列，可用于融合蛋白的纯化或检测。

技术领域

本发明属于抗体技术领域，尤其涉及一种PD-L1纳米抗体、制备方法及其应用。

背景技术

目前，已有一些抗PD-L1的单克隆抗体获批用于癌症的治疗。例如PD-L1抑制剂Tecentriq(Atezolizumab或称MDL3280a)，批准适应症为膀胱癌(尿路上皮癌)。PD-L1在绝大多数肿瘤组织中表达增高，例如乳腺癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤等，PD-L1在肿瘤细胞中的表达也被认为是许多类型的恶性肿瘤的预后因素。为了阻断PD-L1与受体PD1结合，抑制肿瘤发展，免疫治疗抗体药物的研发也非常迅速，opdivo、keytruda、Atezolizumab等知名药物也有着显著效果。因此，在使用这些药物前，进行PD-L1基因解码基因检测是非常有必要的。同济大学医学院肿瘤研究所所长，上海市肺科医院周彩存教授指出，当前的临床试验证据显示，PD-1免疫检查点抑制剂如帕博利珠单抗，在作为单药一线，或联合标准化疗治疗无EGFR/ALK基因突变的非小细胞肺癌时，都显示了比单纯的标准化疗更好的疗效，为病人带来了更显著的生存获益。但是，在判断是单药治疗还是联合化疗治疗时，我们需要根据肿瘤生物标志物PD-L1的表达情况来决定，以取得更精准的效果。目前国外临床研究免疫药物治疗对应的有四种PD-L1检测试剂盒，分别是：罗氏的SP142(用于罗氏的Atezolizumab单抗的PD-L1检测)、罗氏的SP263(用于阿斯利康Durvalumab单抗的PD-L1检测)、Dako的28-8(用于施贵宝的纳武利尤单抗的PD-L1检测)、Dako的22C3(用于默沙东的帕博利珠单抗的PD-L1检测)。

生物免疫治疗相对传统化疗或靶向治疗，有一个本质逻辑区别:“免疫治疗”针对的是免疫细胞(或者说是免疫系统)，而不是癌症细胞。在癌症免疫治疗中，抑制免疫检查点通路被认为是最有前景的治疗方式之一，其机制是通过抑制通路中相关靶点解除T细胞活性受抑状态，活化后的T细胞能够进攻和消灭肿瘤细胞。抗体并不直接作用于肿瘤细胞，而是通过作用于T细胞类间接杀伤肿瘤细胞；另外，它们并不是针对肿瘤表面的某种特定物质，而是系统性地增强了全身的抗肿瘤免疫反应。

纳米抗体是由比利时科学家于1993年在自然杂志中首次报道，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KD，因此也被称作纳米抗体(Nanobody,Nb)。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)单克隆抗体存在异源性。如果用于小鼠单克隆抗体的单克隆抗体，对人体的应用会产生抗鼠单克隆抗体，它不可重复应用，影响其疗效。

(2)单克隆抗体体积相对较大，不能较好的进入肿瘤组织。

(3)单克隆抗体开发周期长，生产成本高，产量低。

(4)单克隆抗体类药物价格昂贵，研发复杂，人源化复杂，成功率有限。

(5)难以大规模生产，单克隆抗体药物在建厂和生产过程中消耗的资金非常巨大