[发明专利]一种TIM-3纳米抗体、制备方法及其应用

说明书

本发明属于来自动物或人的抵抗物质技术领域，公开了一种TIM‑3纳米抗体、制备方法及其应用，纳米抗体为TIM‑3纳米抗体序列为SEQ ID NO：1；TIM‑3抗原为哺乳动物细胞瞬时转染表达，使用TIM‑3抗原对纳米抗体库进行多次筛选，获得特异性的纳米抗体噬菌体，测序得到目的片段。本发明使用HEK293细胞株对抗原进行表达，使用哺乳动物表达系统表达人的蛋白最大化的保证蛋白的原始结构，保证了蛋白拥有翻译后修饰以及糖基化等真核蛋白特有的修饰，使获取的蛋白具有较高活性；该方法最大地的保证了蛋白的原始结构与活性；本发明筛选得到的纳米抗体能高效、特异性的结合到靶点上。

技术领域

本发明属于来自动物或人的抵抗物质技术领域，尤其涉及一种TIM-3纳米抗体、制备方法及其应用。

背景技术

目前，T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T-cell immunoglobulinandmucin-3，TIM-3)，是一种膜蛋白，属于T细胞免疫球蛋白家族的新成员。首次发现是在Th1型淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中。鼠源的TIM-3编码基因存在于第11号染色体上，与人源TIM-3有很高的相似度，而人源的TIM-3编码基因存在于第5号染色体上，含有7个外显子。

研究认为TIM-3只选择性的表达于激活的Th1细胞上，可以作为区分和Th2细胞的新的标志物。TIM-3通过与其配体结合能够发挥抑制Th1细胞的功能。它参与炎症的发生，能够调节免疫细胞的活化与功能，在许多疾病反应中起着非常重要的作用。在非Th1细胞上也会表达，并发挥着不同的生物学功能。当TIM-3与Bat3结合后，它的活性会被抑制。Th1特异性转录因子T-bet能调控TIM-3的表达，而且T-bet可以直接与TIM-3的启动子结合。TIM-3能够调节Th1与Th2细胞的功能，多种疾病的发生也与它的异常表达相关，因此被认为是机体疾病相关的重要基因。

生物免疫治疗相对传统化疗或靶向治疗，有一个本质逻辑区别:“免疫治疗”针对的是免疫细胞(或者说是免疫系统)，而不是癌症细胞。在癌症免疫治疗中，抑制免疫检查点通路被认为是最有前景的治疗方式之一，其机制是通过抑制通路中相关靶点解除T细胞活性受抑状态，活化后的T细胞能够进攻和消灭肿瘤细胞。抗体并不直接作用于肿瘤细胞，而是通过作用于T细胞类间接杀伤肿瘤细胞；另外，它们并不是针对肿瘤表面的某种特定物质，而是系统性地增强了全身的抗肿瘤免疫反应。TIM-3靶点以及TIM-3单克隆抗体是生物免疫治疗中的一个热点。

纳米抗体是由比利时科学家于1993年在自然杂志中首次报道，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KD，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有的单克隆抗体由于分子质量大150ku以及鼠源等问题对人体存在异源性。小鼠的单克隆抗体，对人体的应用会产生抗鼠单克隆抗体，它不可重复应用，影响其疗效。

(2)现有的单克隆抗体体积相对较大，不能较好的进入肿瘤组织；单克隆抗体开发周期长，生产成本高，产量低；单克隆抗体类药物价格昂贵，研发复杂，人源化复杂，成功率有限。

(3)现有的单克隆抗体难以大规模生产，单克隆抗体药物在建厂和生产过程中消耗的资金非常巨大。

(4)现有的单克隆抗体不稳定，容易降解，保存成本高；容易污染，维护成本高昂。在高温和强酸强碱的条件下会分解，须在低温下保存，否则就会在数周内完全失去活性。抗体能被消化系统很快降解，从而阻止了其进入大脑或其他有效作用部位。