[发明专利]多种亚型流感病毒HA2蛋白共同抗原表位、抗体、鉴定方法和应用有效

专利信息
申请号: 202010157367.X 申请日: 2020-03-09
公开(公告)号: CN111440228B 公开(公告)日: 2021-08-24
发明(设计)人: 彭大新;王秋霞;陈素娟;秦涛;孙志豪 申请(专利权)人: 扬州大学
主分类号: C07K14/11 分类号: C07K14/11;G01N33/569;G01N33/68;C07K16/10;A61K39/145;A61P31/16
代理公司: 南京纵横知识产权代理有限公司 32224 代理人: 刘艳艳
地址: 225009 *** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 多种 流感病毒 ha2 蛋白 共同 抗原 抗体 鉴定 方法 应用
【权利要求书】:

1.多种亚型流感病毒HA2蛋白共同抗原表位肽,其特征在于,所述的多种亚型流感病毒HA2蛋白共同优势抗原表位肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.多种亚型流感病毒HA2蛋白共同抗原表位肽的鉴定方法,其特征在于,包括:

(1)初步确定HA2蛋白表位区域:根据H5N1亚型流感毒株S的HA2蛋白序列设计并合成长度为20个氨基酸且互相重叠10个氨基酸的18条多肽,合成后点样至改性硅胶膜,制成多肽芯片,通过血清学方法筛选目的肽段,使用针对不同亚型IAV的抗血清筛选通用表位,并且通过蛋白印迹分析能够验证H1、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9和H10亚型流感病毒的共同抗原表位肽位于H5-14肽序列为SEQ ID NO:2,即14th肽;

(2)确定优势表位序列:将所述14th肽细切为4条互相重叠8个氨基酸的多肽,4个多肽序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:1,点样至改性硅胶膜,制成多肽芯片;

构建通用表位突变的重组病毒,通过蛋白质印迹分析表位与免疫血清的结合能力,确定出最短优势表位序列,所述最短优势表位序列为SEQ ID NO:1;

结果表明,HA2蛋白上485至495位序列SEQ ID NO:1具有与H1,H3,H4,H5,H6,H7,H8,H9和H10亚型IAV抗血清的广谱结合活性。

3.根据权利要求2所述的多种亚型流感病毒HA2蛋白共同抗原表位肽的鉴定方法,其特征在于,构建表位突变的重组病毒,包括:

通过序列分析,根据序列SEQ ID NO:1中相对保守的一段序列“YHKCD”分别设计16种缺失和突变模式,并将改造后的HA基因克隆至pHW2000转录表达载体,同时以S毒株的其余7个基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS为骨架,拯救重组病毒。

4.根据权利要求3所述的多种亚型流感病毒HA2蛋白共同抗原表位肽的鉴定方法,其特征在于,在所拯救的重组病毒中只有S-Y-G、S-H-G、S-K-G和S-D-G具有HA效价并能够在10 d的SPF鸡胚中稳定复制;拯救的病毒S-Y-G、S-H-G、S-K-G和S-D-G分别以MOI=0.1的剂量感染原代鸡胚成纤维细胞12 h,其制成的蛋白样通过Western-Blotting可验证,14th肽偶联BSA的高免血清与S-K-G和S-D-G病毒的HA2蛋白的结合能力显著下降;

和/或,用于S毒株HA基因突变/缺失的引物分别为Y-G F、Y-G R、H-G F、H-G R、K-G F、K-G R、C-G F、C-G R、D-G F、D-G R、R△YHKCD、F△YHKCD、R△HKCD、F△HKCD、R△YKCD、F△YKCD、R△YHCD、F△YHCD、R△YHKD、F△YHKD、R△YHKC、F△YHKC、R△Y、F△Y、R△H、F△H、R△K、F△K、R△C、F△C、R△D和F△D,其序列分别为SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:37;

和/或,通过表位数据库分析预测,优势表位序列SEQ ID NO:1包含HLA-DR1限制性CD4T细胞表位。

5.多种亚型流感病毒抗体,其特征在于,所述抗体是采用权利要求1所述的多种亚型流感病毒HA2蛋白共同抗原表位肽序列偶联BSA,按照免疫程序免疫动物获得的抗血清,所述抗血清即为所述多种亚型流感病毒抗体。

6.多种亚型流感病毒疫苗,其特征在于,所述疫苗包括权利要求1所述的多种亚型流感病毒HA2蛋白共同抗原表位肽。

7.根据权利要求1所述的多种亚型流感病毒HA2蛋白共同抗原表位肽在制备多种亚型流感病毒抗原、疫苗中的应用。

8.根据权利要求1所述的多种亚型流感病毒HA2蛋白共同抗原表位肽在制备鉴定多种亚型流感病毒抗原、抗体的试剂中的应用。

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