[发明专利]一种快速检测格特隐球菌的方法

说明书

本发明属于真菌病原学检测技术领域，公开了一种快速检测格特隐球菌的方法，其包括如下步骤：步骤1）选择待测样本；步骤2）提取格特隐球菌DNA；步骤3）制备实时荧光PCR反应体系；步骤4）荧光PCR扩增。本发明能够快速准确地检测出格特隐球菌，灵敏度和特异性较高。

技术领域

本发明属于真菌病原学检测技术领域，具体涉及一种准确检测格特隐球菌的方法。

背景技术

隐球菌是一种病菌，可导致隐球菌病。媒介一般为干的鸽子粪，鲜有人与人之间传播的报告。尚无特效药，一般进行对症处理。隐球菌病是由隐球菌引起的肺部或播散性感染性疾病，主要引起肺炎和脑膜炎，也引起皮肤、骨骼或内脏器官感染。临床上结合临床表现以及显微镜检查结果进行诊断，再通过真菌培养或组织染色加以确认。临床上治疗药物包括两性霉素B、三唑类抗真菌药物和氟胞嘧啶^。

隐球菌属目前确定的总类一共有37种，其中新生隐球菌和格特隐球菌致病力较强。此前，隐球菌病多为新生隐球菌所致，鲜有格特隐球菌致病的报道。近10年来，关于格特隐球菌病的报道逐渐增多。格特隐球菌之前被认为是新生隐球菌的格特变种(血清型B和C)，直到2002年被确立为一个独立的物种。和新生隐球菌以及其他真菌病原体一样，格特隐球菌可以从土壤以及腐烂的有机材料中分离得到，通过担孢子或隐球菌酵母细胞的吸入感染宿主引起肺炎，经过2-11个月的潜伏期后可以播散和演变为脑膜炎，未经治疗的免疫功能不全的患者潜伏期可能更长。新生隐球菌仅以所有感染免疫缺陷宿主为感染对象，而格特隐球菌以热带和亚热带地区的免疫功缺陷宿主为感染对象，除此之外，其临床表现、治疗药物以及预后均有所不同。

隐球菌病的诊断通常依靠直接镜检、细菌培养临床样本或检测体液中的隐球菌抗原。临床标本常规染色可以发现隐球菌，印度墨汁染色可以识别痰或脑脊液中的隐球菌但敏感性低。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)或乳胶凝技术检测血液中的隐球菌比直接镜检更为敏感。国内已建立了ABC-ELISA法、免疫放射测定法用于检测新生隐球菌抗原，而且特异性和敏感性较高。然而，这些临床微生物实验室难以明确菌种，培养是目前较为常用的可靠的区分格特隐球菌和新生隐球菌的方法。最简单的确定格特隐球菌的方法是把隐球菌分离到刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚蓝培养基中培养：格特隐球菌在培养基上生长并使菌落周围的培养基成为蓝色。

通过培养进行区分格特隐球菌和新生隐球菌的方法工作效率较低，耗费时间长，而且人力物力消耗很大，存在较大的局限性。核酸检测快速便捷，是近年来检测病原体的发展趋势。文献“新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定，冯晓博 《中华皮肤科杂志》 2012年” 建立了一种基于核糖体基因内间隔区（IGS）的多重聚合酶链反应（PCR），用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌，该方法需要针对每一种菌设计引物，方法比较繁琐，反应不够快捷；专利“CN2017101725670”公开了一种检测并鉴定隐球菌的靶基因、引物和探针及试剂盒，属于医学真菌学的领域。根据隐球菌的靶基因，设计该检测隐球菌基因的引物序列如SEQ ID No.3与SEQ ID No.4和/或SEQID No.6与SEQ ID No.7所示，其中SEQ ID No.3与SEQ ID No.4对应于新生隐球菌，SEQ IDNo.6与SEQ ID No.7对应于格特隐球菌，可以在同一体系中用于特异性检测新生隐球菌与格特隐球菌两种隐球菌”，该方法只是将特异性扩增新生隐球菌和格特隐球菌引物和检测探针进行组合，创新性相对较低，而且两套扩增引物，成本更高，扩增反应相对繁琐。

因此，需要新的技术和方法来正确检测并鉴定格特隐球菌。

发明内容

本发明为了克服传统检测格特隐球菌的操作繁琐、灵敏度低、错误率高等缺陷，提供一种准确检测格特隐球菌的方法，该方法可以是诊断目的，也可以是非诊断目的。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种快速检测格特隐球菌的方法，其包括如下步骤