[发明专利]一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用

说明书

本发明公开了一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用，能够明显提高发酵单位，降低硫酸庆大霉素产品的杂质，符合《中国药典》(2015版)的要求。改进前硫酸庆大霉素的发酵单位2000u/ml；生产的硫酸庆大霉素产品其产品总杂＞11％，西索米星＞9％，小诺霉素＞2.5％。本发明硫酸庆大霉素的发酵单位4500u/ml，平均为5007u/ml，较改进前提高176％；生产的硫酸庆大霉素产品其产品总杂＜5％，平均为3.06％，较改进前降低75％；西索米星＜2％，平均为1.55％，较改进前降低84％；小诺霉素＜2.5％，平均为2.37％，较改进前降低9％。

技术领域

本发明涉及一种绛红小单孢菌突变型菌株，具体涉及一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用。属于抗生素发酵技术领域。

背景技术

硫酸庆大霉素为氨基糖苷类抗生素，对各种革兰阴性细菌及革兰阳性细菌都有良好抗菌作用。硫酸庆大霉素的作用机制是与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成；使用现有庆大霉素菌种及生产配方进行发酵生产，发酵单位低，产品杂质高，很难符合《中国药典》2015版的要求。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用，以解决硫酸庆大霉素传统生产中存在的发酵单位低、杂质高等问题。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

1、一种绛红小单孢菌突变型菌株，该菌株为绛红色小单孢菌(Micromonosporapurpurea)CH20190225-107，已于2019年12月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.19254。

2、上述一种绛红小单孢菌突变型菌株的制备方法，先将绛红小单孢菌GM20190109-15(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC11015，中文名：绛红小单胞菌，拉丁名：Micromonosporapurpurea)制备成孢子悬液，然后利用ARTP(常压室温等离子体)诱变育种仪进行诱变并培养成诱变后的单菌落，再筛选在波长325nm下吸收峰高的单菌落，接种培养得发酵液，选择发酵单位高、杂质低的单菌落菌种，后处理即得所述的绛红小单孢菌突变型菌株CH20190225-107冷冻管孢子。

优选的，具体步骤如下：

1)以福安药业集团烟台只楚药业有限公司菌种库中的庆大霉素生产菌株绛红小单孢菌GM20190109-15为出发菌种，用灭菌后的1ml吸管吸取0.1ml接种于灭菌后的斜面培养基上进行斜面孢子培养，培养温度为35～37℃，静置，培养时间为4天，得到GM20190109-15菌种的斜面孢子；

2)取1.0cm²步骤1)制备的斜面孢子加入灭菌的含5ml质量浓度0.9％的生理盐水的三角瓶中，震荡20min，得到孢子悬液；

3)取500μl步骤2)制备的孢子悬液，加入250μl质量浓度20％的氯化锂水溶液，250μl质量浓度0.9％的生理盐水，震荡混匀5min，得到含质量浓度5％氯化锂的孢子悬液；震荡混匀后用移液枪吸取20μl含质量浓度5％氯化锂的孢子悬液置于ARTP(常压室温等离子体)诱变育种仪的样品器中进行诱变，诱变时间设置为60秒，得到诱变后的孢子悬液；

4)将步骤3)制备的诱变后的孢子悬液分别稀释至10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，分别取稀释至10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的稀释液100μl，涂布于含有分离培养基的双碟培养皿中，培养温度35～37℃，静置，培养时间4天，得到诱变后的单菌落；