[发明专利]一种检测鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR引物组及其检测方法

权利要求书

1.一种检测鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR引物对，其特征在于：

上游引物：5’-ACTGCCGTTGATACTGCTA-3’；

下游引物：5’-TCTAATCCTGTTCGCTCCC-3’；

扩增目的片段为163bp，目的片段序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种荧光定量PCR检测鸭疫里默氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的16S rRNA为检测靶基因，设计特异性引物对；

(2)提取鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的RNA，反转录为cDNA；

(3)以步骤2中的cDNA为模板，以步骤1中的引物对为引物，进行普通PCR扩增目的片段，产物纯化后构建重组质粒，并测序验证；

(4)步骤(3)中测序验证正确的重组质粒进行浓度测定，10倍梯度稀释为不同浓度作标准品，-20℃保存备用；

(5)以步骤(4)中的8个梯度的标准品DNA为模板，SYBR Green染料法进行荧光定量PCR反应，建立起始模板拷贝数的对数与阈值循环数之间的标准曲线和标准方程；

(6)将待测样品进行RNA提取和反转录为cDNA，然后使用步骤(1)中的引物对对待测样品进行检测，将所测得的阈值循环数根据标准曲线即可计算出待测样品中鸭疫里默氏菌的拷贝数。

3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测鸭疫里默氏菌的方法，其中步骤(1)中，所述引物对序列为：

上游引物：5’-ACTGCCGTTGATACTGCTA-3’；

下游引物：5’-TCTAATCCTGTTCGCTCCC-3’；

扩增目的片段为163bp，目的片段序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测鸭疫里默氏菌的方法，其中，步骤(3)中的普通PCR的反应体系为25μL：2×Premix 13μL，cDNA模板2μL，ddH₂O 10μL；

反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃10min。

5.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测鸭疫里默氏菌的方法，其中步骤(3)中重组质粒的构建步骤为：

A.将PCR产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳；

B.跑胶结束，紫外灯下观察，将含目的片段的凝胶进行切胶回收；

C.胶回收试剂盒进行PCR胶回收和纯化；

D.连接：PCR纯化产物与PMD-18T载体连接，其反应体系为：PCR纯化产物7μL，pGM-T载体1μL，T4连接酶1μL，10×Ligation Mix 1μL，16℃水浴连接过夜；

E.转化：将10μL连接产物加入DH5α细胞中，轻轻混匀放置10min，42℃热击90s，冰上放置2min后移入加有1ml无抗生素LB的1.5ml离心管中，置于37℃摇床中180rpm/min摇菌45min；

F.涂板：取上述步骤E中的转化菌液100μL加入到含双抗的LB平板中，用三角棒涂抹均匀，置于37℃生化培养箱中过夜培养；

G.阳性质粒鉴定：挑取步骤F过夜培养后的LB板中的菌落5个，进行菌落PCR鉴定，PCR鉴定阳性的菌液送生工生物公司测序，测序序列正确的为阳性质粒菌；

H.阳性质粒的提取：测序正确的阳性质粒菌进行扩大培养后，质粒提取试剂盒提取质粒，测定质粒浓度。

6.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测鸭疫里默氏菌的方法，其中，步骤(5)中，所述荧光定量PCR反应体系为：2×SuperReal PreMix 10μL，50×Rox Reference Dye 0.4μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL，cDNA模板2μL，ddH₂O 7.0μL。