[发明专利]基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法

权利要求书

1.基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)引物设计；从公共数据库中获得Uu、Up、Mh、Mg四种支原体的功能基因序列，用Muscle进行多序列比对，结合工具得到consensus序列；以consensus序列为输入，结合工具剪切得到满足要求的引物序列；以剪切得到的引物序列做blast比对，结合工具得到初步的引物筛选结果，利用公共数据库进行进一步的引物筛选和特异性检测，得到最后的引物集；

(2)微流控芯片制作；所述微流控芯片为碟式芯片，所述芯片固定有步骤（1）所述的生殖道支原体引物；

(3)恒温扩增反应体系配制；将恒温扩增试剂于室温解冻、融化，摇匀并离心；在体系区，吸取9.0μL恒温扩增试剂加入200μL离心管中，并移至PCR模板加样区；在PCR模板加样区，加入9.0μL被检样品或者对照品的DNA，摇匀并离心；

(4)芯片加样；在模板区，从试剂盒中取出芯片使其恢复至室温，用移液器吸取18.0μL步骤（3）配制好的核酸扩增反应体系，从进出样口加入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道即停止加样，并用封口膜封住进出样口，将加样后的芯片固定在低速离心机上，以6000rpm离心30秒后取下；

(5)核酸扩增和结果判读；将碟式芯片放入核酸分析仪中进行扩增，温度63℃，时间50分钟，检测完成后软件将自动对荧光数据进行处理和分析。

2.根据权利要求1所述的基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，其特征在于，所述解脲脲原体（Uu）引物核酸序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述微小脲原体（Up）引物核酸序列如SEQ ID NO.7-12所示，所述人型支原体（Mh）引物核酸序列如SEQ IDNO.13-18所示，所述生殖支原体（Mg)引物核酸序列如SEQ ID NO.19-24所示。

3.根据权利要求1所述的基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，其特征在于，所述引物满足条件如下：1）35%GC含量65%；2）引物不会形成发卡结构，反向互补序列不能长于5mer；3）引物序列不能有超过5个连续单碱基重复；4）引物之间不会形成二聚体。

4.根据权利要求1所述的基于环介导恒温扩增和微流控芯片生殖道支原体检测方法，其特征在于,所述微流控芯片共24个检测反应池，一张芯片可同时检测3个样品 。