[发明专利]一种脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库的构建方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库的构建方法及其试剂盒。本发明首先提供了一种脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库的构建方法，通过一步反应对片段化后的脑膜炎病原体DNA进行末段修复、磷酸化和加A，接头连接及纯化，PCR富集，纯化，即得所述脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库。该方法及其试剂盒能够实现末段修复、磷酸化和加A一步完成，建库步骤少、时间短、成本低，通过加入外源基因组DNA解决了因脑脊液样本核酸量极低难以建库成功的问题，接头连接和文库扩增获得了特异性极高的宏基因组二代测序文库，有效文库比例高；因此，本发明的方法或试剂盒在脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库构建中具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于测序文库构建技术领域。更具体地，涉及一种脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库的构建方法及其试剂盒。

背景技术

随着测序技术的发展，二代测序以准确性高、通量高、价格低的优势成为测序技术的主流。在个性化医疗、遗传疾病和临床诊断等方面，二代测序已经成为一种普遍的技术手段；例如，肿瘤全外显子组测序、全外显子组遗传检测。宏基因组测序(MetagenomicsSequencing)是对环境样品中的微生物群落的基因组进行高通量测序，主要研究微生物种群结构、基因功能活性、微生物之间的相互协作关系以及微生物与环境之间的关系。宏基因组测序研究摆脱了微生物分离纯培养的限制，扩展了微生物资源的利用空间，为环境微生物群落的研究提供了有效工具，近年来，宏基因组测序已成为热点，而市场上鲜少有针对宏基因组二代测序有效的建库试剂盒。

现有构建宏基因组二代测序文库的方法主要包括以下五个步骤：(1)对DNA进行片段化，纯化；(2)对片段化产物进行末端修复，纯化；(3)对末端修复产物进行加A，纯化；(4)对加A产物进行接头连接，纯化；(5)对接头连接产物进行富集。现有构建宏基因组二代测序文库的五个步骤中需要四步纯化，片段后产物、末端修复产物、加A产物和接头连接产物均需要纯化，在多次磁珠纯化上耗时长，步骤繁琐，末端修复步骤和加A步骤无法一体化，且对DNA样本的起始量和质量要求高。可以看出，现有构建宏基因组二代测序文库方法不仅操作成本高，耗时长，而且多步纯化会不可避免地增加DNA样本的损失，对起始量较低和质量较差的DNA样本无法建库成功。

因此，开发一种简化的、特别适用于较低起始量及较差质量的DNA样本(脑脊液样本核酸量极低)的宏基因组二代测序文库的构建方法具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有宏基因组二代测序文库的构建方法的缺陷和不足，提供一种脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库的构建方法及其试剂盒。

本发明的目的是提供一种脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库的构建方法。

本发明另一目的是提供一种构建脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库的试剂盒。

本发明再一目的是提供所述方法或所述试剂盒在脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库构建中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库的构建方法，通过一步反应对片段化后的脑膜炎病原体DNA进行末段修复、磷酸化和加A，接头连接及纯化，PCR富集，纯化，即得所述脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库。

优选地，所述方法包括以下步骤：

S1.片段化后的脑膜炎病原体DNA与反应液A、酶混合液B进行一步反应；

S2.步骤S1的产物与反应液C、反应液D和酶E进行接头连接反应，纯化；

S3.步骤S2的产物与反应液F、反应液G进行文库扩增，纯化，即得所述脑膜炎病原体宏基因组二代测序文库。