[发明专利]一种高产IgG1的重组菌及构建方法

权利要求书

1.一种高产IgG1的重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：

(1)基因的体外合成和扩增

从NCBI数据库获得来源于人源的西妥昔单抗轻链的氨基酸序列和西妥昔单抗重链的氨基酸序列，将所述西妥昔单抗轻链简称LC，将所述西妥昔单抗重链简称HC；

将所述LC的氨基酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的LC；在优化后的LC的核苷酸序列5'、3'端分别加入NdeI限制性酶切位点和SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的LC，在体外合成和扩增；

将所述HC的氨基酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的HC，在优化后的HC的核苷酸序列5'、3'端分别加入NdeI限制性酶切位点和SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的HC，在体外合成和扩增；

所述LC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述HC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述加酶切位点的LC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述加酶切位点的HC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

从NCBI数据库获得来源于大肠杆菌MG1655(Escherichia coli MG1655)的ilvE的核苷酸序列；

将所述ilvE的核苷酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的ilvE；在优化后的ilvE的核苷酸序列5'、3'端分别加入NdeI限制性酶切位点和SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的ilvE，在体外合成和扩增；

从NCBI数据库获得来源于大肠杆菌MG1655(Escherichia coli MG1655)的aspC的核苷酸序列；

将所述aspC的核苷酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的aspC；在优化后的aspC的核苷酸序列5'、3'端分别加入NdeI限制性酶切位点和SpeI限制性酶切位点，得到加酶切位点的aspC，在体外合成和扩增；

所述加酶切位点的ilvE的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述加酶切位点的aspC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

(2)设计引物alaA-F和alaA-R，通过PCR方法从大肠杆菌MG1655的基因组DNA扩增出alaA核苷酸序列；

设计引物gdhA-F和gdhA-R，通过PCR方法从大肠杆菌MG1655的基因组DNA扩增出gdhA核苷酸序列；

设计引物serB-F和serB-R，通过PCR方法从大肠杆菌MG1655的基因组DNA扩增出serB核苷酸序列；

设计引物pheA-F和pheA-R，通过PCR方法从大肠杆菌MG1655的基因组DNA扩增出pheA核苷酸序列；

alaA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；alaA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；gdhA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；gdhA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；serB-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；serB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；pheA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；pheA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；所述alaA的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述gdhA的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述serB的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述pheA的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

(3)将步骤(1)获得的加酶切位点的LC和加酶切位点的HC分别连接到p2A4UV5载体中，得到p2A4UV5-LC和p2A4UV5-HC；将p2A4UV5-LC用SpeI和PstI限制酶进行酶切，将p2A4UV5-HC用XbaI和PstI限制酶进行酶切，将p2A4UV5-HC酶切的核苷酸片段连接到p2A4UV5-LC酶切的核苷酸片段的3'端，得到p2A4UV5-AB；

将步骤(1)获得的所述加酶切位点的ilvE的核苷酸序列连接到p3C5BAD载体中得到p3C5BAD-IlvE；

将步骤(1)获得的所述加酶切位点的aspC的核苷酸序列连接到p3C5BAD载体中得到p3C5BAD-AspC；

将步骤(2)获得的所述alaA的核苷酸序列连接到p3C5BAD载体中得到p3C5BAD-AlaA；将步骤(2)获得的所述gdhA的核苷酸序列连接到p3C5BAD载体中得到p3C5BAD-GdhA；

将步骤(2)获得的所述serB的核苷酸序列连接到p3C5BAD载体中得到p3C5BAD-SerB；

将步骤(2)获得的所述pheA的核苷酸序列连接到p3C5BAD载体中得到p3C5BAD-PheA；

所述p2A4UV5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述p3C5BAD载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

(4)将p2A4UV5-AB和p3C5BAD-IlvE导入大肠杆菌中，得到重组菌2；将p2A4UV5-AB和p3C5BAD-AspC导入大肠杆菌中，得到重组菌3；将p2A4UV5-AB和p3C5BAD-AlaA导入大肠杆菌中，得到重组菌4；将p2A4UV5-AB和p3C5BAD-GdhA导入大肠杆菌中，得到重组菌5；将p2A4UV5-AB和p3C5BAD-SerB导入大肠杆菌中，得到重组菌6；将p2A4UV5-AB和p3C5BAD-PheA导入大肠杆菌中，得到重组菌7。

2.权利要求1的方法构建的一种高产IgG1的重组菌。