[发明专利]一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒、方法及引物探针组合物

说明书

本发明是一种用于同步检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、S基因和人B2M基因的多重反转录实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针组合，该试剂盒采用单管四荧光通道同时检测三个2019新型冠状病毒基因和一个人内参基因，能检测呼吸道和血液样本中2019新型冠状病毒RNA的存在。本发明检测周期短、特异性强、灵敏度高、漏检率低、重复性好，能通过对人内参基因的检测结果对样本的提取和扩增过程进行质量监控，并通过dUTP‑UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染导致的假阳性结果出现。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种检测2019新型冠状 病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒、方法及引物探针组合物。

背景技术

人感染2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)后导致的肺炎称为新 型冠状病毒肺炎(COVID-19)，常见体征包括呼吸道症状、发热、咳 嗽、气促和呼吸困难，在重症病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼 吸综合征、肾衰竭甚至死亡，截止目前尚无特异性治疗方法，因此早 发现早隔离是最为有效的遏制疫情发展的措施。国家卫健委发布的 《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》中明确指出，新型 冠状病毒感染的检测方法为反转录实时荧光定量PCR，且检测方法主 要针对新型冠状病毒基因组开放阅读框1ab(open readingframe 1ab， ORF1ab)和核壳蛋白(nucleocapsid protein，N)，若同一份标本中新 型冠状病毒两个靶标特异性反转录实时荧光定量PCR检测结果均为 阳性，则判定病例为阳性，但是同时指南也指出，由于病毒变异导致 阴性情况的存在，阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一 种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒、方法及 引物探针组合物。本发明试剂盒采用单管四荧光通道同时检测三个 2019新型冠状病毒基因(ORF1ab基因、N基因和S基因)和一个人 内参基因(B2M基因)，设计检测针对呼吸道和血液等样本中的2019 新型冠状病毒RNA。本发明检测周期短、特异性强、灵敏度高、漏 检率低、重复性好，使用人内参基因内标可以做到对检测中样本的提 取和扩增全过程进行质量监控，并通过dUTP-UNG酶防污染体系降 低由气溶胶污染导致的假阳性结果出现。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

本发明所提供的用于对2019新型冠状病毒ORF1ab基因、N基 因、S基因和人B2M基因的多重反转录实时荧光定量PCR检测试剂 盒主要包括2019新型冠状病毒检测预混液、RT-PCR酶液(包含逆转 录酶、热启动rTaq酶以及UNG酶)、2019新型冠状病毒阳性对照、2019新型冠状病毒阴性对照。

2019新型冠状病毒检测预混液中包括多重反转录实时荧光定量 PCR反应所需的dNTP、dUTP、Mg²⁺、缓冲液、用于扩增2019新型 冠状病毒ORFlab基因、N基因、S基因和人B2M基因的引物、用 于检测2019新型冠状病毒ORFlab基因、N基因、S基因和人B2M 基因的探针(表1)。用于扩增和检测2019新型冠状病毒的正反向引 物序列和探针序列信息如表2所示；其中，用于检测2019新型冠状 病毒ORFlab基因的探针5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光 猝灭基团BHQ-1；用于检测2019新型冠状病毒N基因的探针5’端添 加荧光报道基团Cy5，3’端添加荧光猝灭就团BHQ-2；用于检测2019 新型冠状病毒S基因的探针5’端添加荧光报道基团ROX，3’端添加 荧光猝灭基团BHQ-2；用于检测人B2M基因的探针5’端添加荧光报 道基团VIC，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2。由上述正反向引物和探 针序列的衍生序列也属于本发明内容，所述衍生序列是指在SEQ ID NO：1～12的基础上在序列的5’端或3’端添加或减少一个或多个碱基 得到的序列。为避免多重反转录实时荧光定量PCR过程中被延伸， 所述探针的3’端已经过磷酸化处理。

表1 2019新型冠状病毒检测预混液各组分配比(单次反应)