[发明专利]基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量计量基准方法

说明书

本发明基于荧光标记流式单分子计数蛋白质含量绝对测量方法包括：将待测蛋白质纯品用稀释液配制成或分步稀释至0.1mg/g‑1mg/g，稀释倍数记录D₁；对稀释后蛋白质分子进行荧光标记，使荧光染料与每个蛋白质分子结合；将溶液中标记好荧光标记蛋白质与过量荧光染料进行分离；用稀释液对纯化好的荧光标记蛋白质继续稀释至100‑1000分子/μL浓度水平，稀释倍数为D₂，测量溶液质量流速f，用单分子分析仪对荧光标记蛋白质溶液直接进行流式计数,得到单分子计数结果w；根据由单分子分析仪照射出来激光斑点和毛细管几何尺寸算出检测概率p；根据单分子计数结果w、质量流速f、稀释倍数D和检测概率p，计算蛋白质溶液质量浓度。

技术领域

本发明涉及生物化学检测领域，特别是涉及一种基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量计量基准方法。

背景技术

计量是实现单位统一、量值准确可靠的活动，研究建立高准确度的测量方法是计量学研究的重要内容之一。基准测量方法是一种具有最高计量学品质的测量方法，其操作可以被完全地描述和理解，最终不确定度可以用SI单位表述，测量结果不依赖被测量的测量标准。基准方法是形成量值源头的依据。

随着生命科学和生物技术的发展，生命科学已经经历了从“描述生物学”向“实验生物学”再向“创造生物学”发展的过程，当今的生物学已经成为精准定量的科学。没有对生命体各类生命现象的精确测量，便难以对生命过程进行全方位的调控与干预。蛋白质作为一类重要的生物大分子，是生命活动的主要承担者，在体内各个生命活动如营养代谢、酶催化、激素、免疫、遗传、变异等过程中均离不开蛋白质功能的发挥。鉴于蛋白质生物体内的重要作用，它已经成为众多领域的检测靶标。例如在体外诊断中，常见的体外诊断项目中有一半以上检测对象为蛋白质；在食品安全中，160多种食品含有可以导致过敏反应的食品过敏原，其中大于90％的过敏原都是蛋白质，根据国内食品标签标识管理规定，相应的蛋白质过敏原均应被检测并被标识；在生物医药领域，目前已经批准150多个蛋白质药物上市，400多种蛋白质药物处于临床研究阶段，3000多种处于临床前研究阶段。不论是体外诊断，还是食品安全与用药安全，这些都关乎大众健康与国计民生，相关领域蛋白质检验结果的准确可比则是保证大众健康与安全的基石！

通过建立量值溯源传递体系来保证检测结果的准确一致已经成为共识，是计量界的通行做法并在传统的物理计量与化学计量领域得到广泛和成功的应用。量值溯源传递体系的建立一是要有量值的源头，二是要有量值传递方法，尤其是要有具有较高测量准确度的“基标准”方法，才能保证国家基准复现的量值能够准确的传递到下一级的标准物质或工作计量器具上。高准确度量值传递方法的缺乏将导致即使国家基准能够复现出量值，也无法准确的传递下去，从而使得保证检测结果的准确可比成为空谈。因此，高准确度的计量方法研究在计量及量值溯源传递中具有举足轻重的作用。

蛋白质含量是蛋白质的基本属性，它描述了被定义的“蛋白质分子”数量的多少，是蛋白质测量的基本量值，在各类蛋白质检测项目中占到了80％以上。因此，要保证蛋白质含量检测结果的准确可比，必须研究建立高准确度的蛋白质含量计量方法，才能实现蛋白质量值的准确传递，从而达到检测结果准确可比、实现检测结果的互通与互认、保证贸易公平、保护人民大众健康的目的。

蛋白质含量测量方法按照测量准确度可以分为常规测量方法和高准确度的计量(潜)基准测量方法，常用的计量(潜)基准方法包括同位素稀释质谱法、质量平衡法和定量核磁法。按照测量原理可以分为滴定法、光谱法、色谱法、质谱法、电泳法、波谱法、综合法等，例如，常用的凯氏定氮、微量凯氏定氮等属于滴定法；双缩脲法、Folin-酚法(Lowry法)、考马斯亮蓝法等属于比色光谱法。按照测量过程中是否需要上一级标准，可以分为蛋白质含量绝对测量方法和相对测量方法两类。蛋白质含量绝对测量方法在测量过程中不需要同样的标准物质作为标准，而相对测量方法在测量过程中需要相应的标准物质绘制标准曲线，或者通过括弧法或单点法进行定量。质量平衡法、定量核磁法、凯氏定氮法属于绝对测量方法，而同位素稀释质谱法、液相色谱法、比色法等大多数蛋白质含量测量方法都属于相对测量方法。