[发明专利]一种用于表达施式假单胞杆菌肌酐酶的大肠杆菌工程菌

权利要求书

1.一种用于表达施式假单胞杆菌肌酐酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体转化到大肠杆菌而获得：

所述外源DNA为施式假单胞杆菌假单胞杆菌肌酐酶的DNA编码序列，所述施式假单胞杆菌肌酐酶的氨基酸序列如Seq No.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种用于表达施式假单胞杆菌肌酐酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述外源DNA序列如Seq No.1所示。

3.根据权利要求2所述的一种用于表达施式假单胞杆菌肌酐酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述表达载体为将所述外源DNA克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+)，得到的表达载体pET28a(+)-CRN。

4.根据权利要求3所述的一种用于表达施式假单胞杆菌肌酐酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌工程菌是所述表达载体pET28a-CRN后转化到大肠杆菌而得，所述DNA编码序列及其调节基因构成的表达盒整合到大肠杆菌的基因组中。

5.一种用于表达施式假单胞杆菌肌酐酶的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、编码基因的获取：以施式假单胞杆菌肌酐酶的氨基酸序列为基础，对序列按照大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的对应编码序列；施式假单胞杆菌假单胞杆菌肌酐酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤二、表达载体的构建：将步骤一获取的编码基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+)，得到表达载体pET28a-CRN；

步骤三、表达载体转化及大肠杆菌工程菌获取：将表达载体pET28a-CRN将表达载体pET28a-cre转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养后筛选阳性转化子，并对筛选的阳性转化子进行鉴定，鉴定正确的转化子即为大肠杆菌工程菌BL21(DE3)/pET28a-CRN。

6.根据权利要求5所述的一种用于表达施式假单胞杆菌肌酐酶的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：阳性转化子的筛选是在卡那霉素抗性平板进行。

7.根据权利要求5所述的一种用于表达施式假单胞杆菌肌酐酶的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：对阳性转化子进行的鉴定以CTase5196-F和CTase5765-R为引物进行PCR鉴定，其中CTase5196-F的序列如Seq No.3所示，CTase5765-R的序列如Seq No.4所示。

8.一种重组施式假单胞杆菌肌酐酶，其特征在于：该重组施式假单胞杆菌肌酐酶是由权利要求1-4中任意一项所述的大肠杆菌工程菌进行发酵而获得。

9.根据权利要求8所述的一种重组施式假单胞杆菌肌酐酶，其特征在于，其发酵方法为如下：挑取重组大肠杆菌工程菌接种到LB培养基，37℃，120rpm培养16h，然后将培养的菌液按1％接种量转接至1000mL的TB液体培养基(50μg/mL卡那霉素)中，37℃，120rpm培养至OD600约为0.4-0.8。降温至25℃，120rpm条件下培养12-18h；8000rpm离心15min处理发酵液，除去上清，用蒸馏水将菌体洗涤两次后加入50mM PBS(pH7.4)悬浮细胞，在冰浴条件下利用超声波细胞粉碎机对重组大肠杆菌进行破碎；对破碎后的悬浮液进行冷冻离心处理，8000rpm，4℃，40min，取离心上清液，用亲和层析方法对发酵上清液的重组肌酐酶进行纯化即可。

10.一种如权利要求8或9所述的重组施式假单胞杆菌肌酐酶在肌酐检测中的应用。