[发明专利]一种谷子大斑病早期诊断的方法

权利要求书

1.一种谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取样本DNA；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列为引物组进行PCR；

(3)对PCR扩增产物进行检测；

所述SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列如下：

SEQ ID No.4：5’-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3’；

SEQ ID No.5：5’-CCCAGCAAGAGGGAGACAA-3’。

2.根据权利要求1所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用25.0μL的PCR反应体系，其中2×Es Taq Master Mix 12.5μL，引物浓度都为10μM，加入量各1.0μL，模板DNA 1.0μL，ddH₂O 9.5μL。

3.根据权利要求2所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

4.根据权利要求1-3任一项所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR能扩增出194bp的特异性条带则说明样本已被谷子大斑病菌侵染。

5.根据权利要求1所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(2)中进行实时荧光定量PCR。

6.根据权利要求5所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(2)中实时荧光定量PCR的反应体系为20μL：10μL2×SYBR Premix，0.4μL ROX Reference Dye，引物各0.8μL，2μL DNA模板，6μL不含核酸酶的水。

7.根据权利要求6所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(2)中实时荧光定量PCR的反应条件为：50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，运行40个循环；然后95℃15s，60℃1min，再从60℃每秒上升0.3℃至95℃15s，收集荧光，用于绘制熔解曲线。

8.根据权利要求7所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，所述步骤(3)中以不同浓度的阳性质粒DNA样品为模板进行荧光定量PCR，绘制出反应的标准曲线，根据检测样品循环阈值对其模板含量进行定量分析。

9.根据权利要求8所述的谷子大斑病早期诊断的方法，其特征在于，绘制的标准曲线为Y＝-3.523X+27.818，R²＝0.999。