[发明专利]一种冷冻保存液在器官和组织冻存中的应用

说明书

本发明公开了一种冷冻保存液在器官和组织冻存中的应用。冷冻保存液含有PVA，乙二醇和蔗糖。所述冷冻保存液以PVA为主要低温保护剂成分，DMSO含量低，毒性小，用于卵巢组织或器官时，具有较高的保存效率。本发明的冷冻保存液组成简单，且原料来源方便，成本低廉，可广泛应用于各类细胞、组织以及器官的冷冻保存。

本申请要求2019年4月9日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为201910282416.X，发明名称为“一种基于PVA的冷冻保存液及其制备方法”的在先申请的优先权。该在先申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种冷冻保存液在器官和组织冻存中的应用。

背景技术

冷冻保存是指将细胞、组织或器官保存于超低温状态下，使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。该技术自问世以来，成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一，已被广泛采用。近年来，随着生活压力的增加，人类生育力呈逐年下降的趋势，生育力保存越来越受到人们的重视，人类生殖细胞(精子、卵母细胞)、性腺组织等的冷冻保存就成为保存生育力的重要手段。另外，随着世界人口老龄化加剧，对捐赠的可用于再生医学和器官移植的人源性细胞、组织或器官的冷冻保存的需求也极速增加。因此，如何高效的冷冻保存珍贵的细胞、组织以及器官资源以备不时之需成为亟待解决的科学技术问题。

目前最常用的冷冻保存方法为玻璃化冷冻。玻璃化冷冻技术虽然在快速冷冻过程中可使细胞内外的液体直接成为玻璃态而避免了冷冻过程中因冰晶形成而导致的损伤。但是，在复温过程中，现有的冷冻保存试剂不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞。目前玻璃化冷冻方法所使用的高浓度(≥15％)的有机溶剂，如：DMSO，导致冷冻保存试剂对细胞的毒副作用，严重影响冷冻保存对象复苏后的存活率甚至(子代)安全性以及功能表达。综上，目前采用的冷冻保存试剂不具备复温过程中有效控制冰晶生长的能力，同时存在试剂毒性大的问题。

发明内容

为改善现有技术的上述缺陷，本发明提供一种基于PVA的冷冻保存液及其制备方法和应用。

本发明提供如下技术方案:

一种冷冻保存液，以每100mL体积计，含有PVA 0.01-6.0g，多元醇5.0-45mL，水溶性糖0.1-1.0mol L^-1，DMSO 0-15mL，血清0-30mL，和缓冲液余量。

根据本发明，所述PVA选自无规PVA，例如所述PVA的间同规整度为45％-65％、50％-55％。

根据本发明，所述PVA可选自分子量为10-500kDa或者更高分子量的PVA，例如分子量为10-30kDa、30-50kDa、80-90kDa、200-500kDa。

根据本发明，所述PVA可选自水解度为大于80％的PVA，例如水解度为80％-99％、82-87％、87％-89％、89％-99％、98％-99％。

根据本发明，所述多元醇可以为碳原子数2-5的多元醇，优选碳原子数2-3的二元醇、三元醇，例如乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种。

根据本发明，所述水溶性糖可以为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种，例如选自蔗糖、海藻糖、水溶性纤维素、聚蔗糖；优选蔗糖、羟丙基甲基纤维素等。所述水溶性糖可以起到保护细胞膜和避免细胞沉降的作用。

根据本发明，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或替代物，例如十二烷基磺酸钠SDS，针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清或牛血清白蛋白。

根据本发明，所述缓冲液可以为DPBS、hepes-buffered HTF缓冲液、其他已知的细胞培养缓冲液中的至少一种。