[发明专利]来源于土曲霉菌NIH2624的转氨酶突变体及其应用

说明书

本发明公开涉及来源于土曲霉菌Aspergillus terreus NIH2624转氨酶突变体的多肽、编码所述多肽的多核苷酸以及使用所述多肽在(R)‑3‑氨基‑1‑苄基哌啶制备上的应用。本发明通过计算机模拟为指导定向改造土曲霉菌Aspergillus terreus NIH2624转氨酶，改造氨基酸位点选自Y60、R79、W184、E213、G216、F217、N218、L235、G237、V238、T239、C273、T274及T275中的一个或多个。经改造获得的突变体应用于(R)‑3‑氨基‑1‑苄基哌啶的生产，具有优良的立体选择性和催化活力，且其催化的反应温和，在相同的生产条件下，其活力相对于野生型转氨酶提高了86.96倍，产物手性纯度及收率均有明显提高，具有较好的应用前景。

技术领域：

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种来源于土曲霉菌NIH2624的转氨酶突变体及其应用。

背景技术：

2017年底，国际糖尿病联盟(IDF)公布了第八版的全球糖尿病概览。结果显示，全球糖尿病成人患者(20-79岁)从2000年的1.51亿，到2017年已达到4.25亿，增加近2倍。预计到2045年，糖尿病患者可能达到6.29亿。糖尿病主要是由于机体胰岛素分泌不足或胰岛素作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢疾病。其中胰岛素分泌不足被定义为Ⅰ型、胰岛素作用障碍被定义为Ⅱ型糖尿病，Ⅱ型糖尿病患者占糖尿病患者的90％以上。目前治疗Ⅱ型糖尿病的药物主要分为磺酰脲类、双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂、噻唑烷二酮类、二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂等几大类，其中目前公认最为高效安全的是(DPP-IV)抑制剂，该类药物能够选择性与二肽基肽酶IV 可逆性结合从而抑制二肽基肽酶IV的活性，进而延缓胰高血糖素样肽 -1(GLP-1)和抑胃肽(GIP)降解，从而调节糖尿病Ⅱ型患者的血糖水平。

目前(DPP-IV)抑制剂类降血糖药物阿格列汀、曲格列汀及利拉列汀的重要药物中间体(R)-3-氨基-1-苄基哌啶，在总生产成本中占有较大比例。现在主要生产工艺是采用化学还原的方法制备手性胺，即在Pd/C的催化作用下，前手性酮与甲酸以及无机氨/有机伯胺进行反应生成外消旋胺。此类反应中金属催化剂是非常关键的因素，且对金属催化剂要求苛刻，反应需要在高压条件下完成，操作设备要求高，同时产生大量含重金属离子的废水难以处理，对环境造成较大污染。另外，金属催化合成所需构型的手性胺含量通常为50％，远远不能满足手性胺含量≥99.5％的需求，因此需要后续进行拆分精制，在浪费一半的产品、降低生产效率的同时，还产生大量废有机溶剂，加大了环保处理的压力。

发明内容：

为解决上述问题，本发明以来源于土曲霉菌 Aspergillus terreus NIH2624的转氨酶基因XP_001209325.1为研究对象，通过计算机模拟软件对XP_001209325.1理性预测并进行定点突变，以提高转氨酶的选择性及活性。

本发明的主要目的是提高来源于土曲霉菌Aspergillus terreus NIH2624 的转氨酶对非天然底物1-苄基-3-哌啶酮催化活力，得到酶活显著提高的转氨酶突变体，解决现有(R)-3-氨基-1-苄基哌啶合成技术中存在的缺陷。

本发明的技术方案如下：

步骤1：候选转氨酶与反应底物1-苄基-3-哌啶酮的分子对接评估(三级结构未鉴定的候选转氨酶以同源建模的形成完成对接)。

步骤2：针对分子对接结果优选评估分数较高的转氨酶进行活性测试。

步骤3：选择催化活性与立体选择性最高的Aspergillus terreus NIH2624 的转氨酶作为本发明的野生型转氨酶。

步骤4：利用模拟软件虚拟突变Aspergillus terreus NIH2624转氨酶活性中心周围单个氨基酸。

步骤5:Aspergillus terreus NIH2624转氨酶活性中心氨基酸区域虚拟组合突变。