[发明专利]一种基于PCR-RFLP快速鉴定草地贪夜蛾的方法

说明书

本发明公开了一种基于PCR‑RFLP快速鉴定草地贪夜蛾的方法。本发明通过分析草地贪夜蛾与其它近缘种在COI序列上的差异，以及草地贪夜蛾两种生物型在Tpi序列上的差异，获得了草地贪夜蛾及其生物型特异性的SNP位点，并针对其中的SNP位点设计了相应的限制性内切酶。采用基于聚合酶链式反应的限制性酶切图谱多样性分析技术(PCR‑RFLP)实现了草地贪夜蛾及其生物型的快速鉴定。为基层农业技术人员以及相关农业科研人员开展草地贪夜蛾鉴定、预测预报和防治提供了一种新的便利方法。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于PCR-RFLP快速鉴定草地贪夜蛾的方法。

背景技术

草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)是一种原产于南美洲的爆食性农业害虫，被列为我国重要的检验检疫对象。它具有很强的迁飞能力，扩散能力非常强。2019年1月首次在我国云南被发现。不到一年的时间，该害虫已经扩散至29个省份。目前，草地贪夜蛾在我国主要为害玉米，可造成作物减产15-73％。此外，已经发现该害虫还能够为害小麦、大豆、甘蔗等。在美国和非洲，草地贪夜蛾还能够严重为害水稻。因此，该害虫对我国水稻生产也带来了潜在的严重威胁。

草地贪夜蛾目前主要在我国玉米上严重为害，与玉米上常发的其它鳞翅目害虫，如斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、黏虫等高度相似，给基层农业技术人员的测报和防治工作带来了困难。此外，草地贪夜蛾有两种不同的生物型，玉米型(Corn strain,C型)和水稻型(Ricestrain,R型)。前者主要为害玉米、棉花、高粱等作物，后者主要为害水稻、苜蓿、狗牙根草等。两种生物型几乎不能从外表上加以区分，但它们在生理、生态、行为等方面却出现了很大的分化。例如，玉米型对二嗪农、西维因等杀虫剂具有更高的抗药性，而水稻型则对虫螨威具有更高的抗药性。此外，玉米型对转Bt基因的棉花具有更高的耐受性。这就更加需要我们准确地鉴定草地贪夜蛾的生物型，并针对性地开展测报和防治工作。

以往对近缘种害虫的鉴定一般都采用DNA barcoding(条形码)方法。即克隆线粒体细胞色素氧化酶(COI)，然后测序，并构建系统进化树进行聚类分析，最后加以鉴定。但这种方法依赖于大量的测序，不仅费时，也不经济。此外，这种方法不能用于草地贪夜蛾生物型的鉴定。COI是一种线粒体基因marker(分子标记)，属于母系遗传。因此，这种遗传标记无法对两种生物型杂交的后代进行准确的鉴定。为此，目前主要采用核基因——磷酸丙糖异构酶(Tpi)进行生物型的鉴定。Nagoshi R.N.(2010)开发出了TPi上的10个SNP，根据这个10个SNP来区分水稻型和玉米型草地贪夜蛾。这个方法后来被广泛采用。然而，这种方法也高度依赖于DNA测序，同样费时、不经济。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题为：如何快速的鉴定草地贪夜蛾及其近缘种。

本发明所要解决的第二个技术问题为：如何快速的鉴定草地贪夜蛾两种生物型。

本发明的技术方案为：一种基于PCR-RFLP快速区分草地贪夜蛾及其近缘的方法，包括如下步骤：

(1)提取待鉴定材料的基因组DNA；

(2)以P1和P2为引物，步骤(1)得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到大小为697bp的COI基因片段；P1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，P2的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

(3)对步骤(2)得到的COI基因片段进行两轮酶切：

1)第一轮，采用Tail和AlWN I对步骤(2)得到的COI基因片段进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，并对电泳结果进行拍照、分析：同时具有347bp、263bp和87bp条带的为草地贪夜蛾和斜纹夜蛾，350bp条带的为甜菜夜蛾，697bp条带的为黏虫；