[发明专利]一种重组鳗弧菌OmpA蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组鳗弧菌OmpA蛋白，其特征在于，所述重组鳗弧菌OmpA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组鳗弧菌OmpA蛋白用于增强水产动物对鳗弧菌的免疫。

2.根据权利要求1所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白，其特征在于，编码所述重组鳗弧菌OmpA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)以鳗弧菌C312为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增外膜蛋白OmpA基因；(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物与pEASY-T1 simple载体连接，连接液转化大肠杆菌DH5a，筛选质粒为OmpA-Ts；(3)利用限制性内切酶SmaI对所述OmpA-Ts载体进行酶切，酶切产物纯化，回收得到OmpA基因片段；(4)将载体pET259用SwaI酶切后回收并将其与步骤(3)回收得到的OmpA基因片段用T4 DNA连接酶连接后连接液转化大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pEtOmpA；(5)再将所述质粒pEtOmpA转化大肠杆菌BL21(DE3)，表达即为SEQ ID NO.1中的氨基酸序列所示的重组鳗弧菌OmpA蛋白；

所述引物为F1:5’-CCCGGGATGATAACGATAAATAGGAAAG–3’；

R1:5’-CCCGGG TTTCACTTCATAATCAAAGCT-3’；

所述鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNO.6250。

4.一种鳗弧菌疫苗，其特征在于，所述鳗弧菌疫苗的原料包括如权利要求1或2所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白。

5.根据权利要求4所述的鳗弧菌疫苗，其特征在于，采用腹腔注射所述鳗弧菌疫苗的方式进行免疫，所述重组鳗弧菌OmpA蛋白的用量为10μg/次，免疫一次后采用lx10⁷cfu/ml的鳗弧菌对被免疫水产动物进行攻毒，相对免疫保护效率可达74％。

6.根据权利要求4或5所述的鳗弧菌疫苗，其特征在于，所述鳗弧菌疫苗的原料还包括佐剂。

7.根据权利要求6所述的鳗弧菌疫苗，其特征在于，所述佐剂为Al(OH)₃，所述佐剂由5wt％NaOH和5wt％Al₂(SO₄)₃以2:5的体积比混合、离心后，将离心所得沉淀悬浮于PBS中至0.2mg/ml制备得到；所述鳗弧菌疫苗中重组鳗弧菌OmpA蛋白与佐剂的质量比为1:1。

8.根据权利要求1或2所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白在制备增强水产动物免疫力的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白的应用，其特征在于，所述水产动物包括但不限于鱼类、虾类和贝类。

10.根据权利要求9所述的重组鳗弧菌OmpA蛋白的应用，其特征在于，所述水产动物为牙鲆。