[发明专利]一种石蜡包埋三维悬浮细胞团的免疫荧光染色方法

说明书

本发明涉及一种石蜡包埋三维悬浮细胞团的免疫荧光染色方法，该方法包括如下步骤：对三维悬浮细胞团进行预处理后，浸入石蜡液中包埋切片，进行抗原修复，再进行免疫荧光染色。本发明提供的方法细胞团内部细胞染色充分，结果准确，可以观察悬浮细胞团整体的蛋白表达和分布情况，且仅需要普通的荧光显微镜即可进行样本观察。

技术领域

本发明涉及细胞生物学及相关检测领域，具体涉及一种石蜡包埋三维悬浮细胞团的免疫荧光染色方法。

背景技术

免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，该方法将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

目前，有关3D悬浮细胞团(球)的免疫荧光染色方法主要包括：(1)离心法；缺陷是离心会造成部分细胞团损失、细胞受到损害、散掉变形，细胞团内部细胞染色不充分。(2)借助染色装置染色法；缺陷是去除残留液体不完全或细胞团容易变干，一个装置只能做一组样品，浪费试剂和抗体。并且，以上方法均需要借助价格昂贵的激光共聚焦显微镜观察染色结果，细胞团内部细胞染色效果无法判断。

如果直接使用经典石蜡包埋技术进行3D悬浮细胞团包埋后的免疫荧光染色，则会出现染色效果差、背景很深或染不上色、细胞团切片容易从玻片上脱落等问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的3D悬浮细胞团(球)免疫荧光染色技术的缺陷，提供了一种石蜡包埋3D悬浮细胞团的免疫荧光染色方法。本发明通过改进石蜡包埋前样品的预处理方法、石蜡切片后样品的抗原修复方法等，最终获得了可以成功进行石蜡包埋3D悬浮细胞团免疫荧光染色的技术方案。

具体而言，本发明提供一种石蜡包埋三维悬浮细胞团的免疫荧光染色方法，该方法包括如下步骤：对三维悬浮细胞团进行预处理后，浸入石蜡液中包埋切片，进行抗原修复，再进行免疫荧光染色。

本发明所述细胞团可以是从动物体内取出的或人工培养的悬浮细胞团。

作为本发明的一种具体实施方式，所述细胞团为人胚胎干细胞细胞团，或是由人胚胎干细胞分化所得细胞的细胞团。

本发明所述预处理包括依次进行的：固定、脱水以及透明。

作为本发明的一种优选实施方式，所述固定采用3～5％甲醛溶液，在室温固定0.5～1.5h。

作为本发明的一种优选实施方式，所述脱水依次采用浓度为65～75％、85～95％、100％的乙醇逐级进行。每次孵育时间4～6min。

作为本发明的一种优选实施方式，所述透明包括：将脱水后的细胞团在二甲苯中进行至少一次孵育，优选为2～4次，每次孵育时间4～6min。透明完成后，需晾干细胞团。

本发明将预处理后的细胞团浸入石蜡液中包埋。作为本发明的一种优选实施方式，将细胞团浸入温度57～60℃的石蜡液，使其均匀分散沉入石蜡液的底部；浸蜡的时间优选为8～12min。

本发明所述切片的厚度优选为3～20μm。

本发明提供的方法在切片后，优选将载有细胞团的玻片烘干，然后脱蜡复水。

所述烘干的目的是去除切片中的水分，让切片更加粘牢在玻片上。作为本发明的一种优选实施方式，所述烘干是将切好的片子置于40～45℃的烘箱中烘干。所述烘干时间优选为8～16小时。

所述脱蜡复水的目的是便于染色，如果脱蜡不彻底，会使切片不易着色。作为本发明的一种优选实施方式，所述脱蜡包括：在二甲苯中浸泡至少一次，每次4～6min。作为本发明的一种优选方案，所述复水依次采用浓度为100％、85～95％、65～75％的乙醇逐级进行，每次2～4min。