[发明专利]一种单细胞单管样品制备及单细胞蛋白质组学分析方法

说明书

本发明属于细胞蛋白组分析技术领域，具体涉及一种基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，步骤为：采用DDM对测试管内壁进行预处理；向预处理后的测试管中加入待测定的单细胞；利用单一测试管(例如PCR管)对单细胞进行裂解和蛋白质变性、还原烷基化、酶解等处理，在所述的测试管中获得单细胞蛋白质组分析的多肽待测溶液。本发明还包含对所得到的待测样品直接进样，进行液相色谱串联质谱(LC‑MS/MS)分析的方法。本发明能够有效克服单细胞蛋白质丢失的问题，能够有效改善单细胞蛋白质组学分析的效果。此外，该方法简便，高效，不需要额外的仪器和其他试剂，可以在普通的蛋白质组学实验室容易得到实施，为单细胞蛋白质组学的发展提供了新的分析工具。

技术领域

本发明属于蛋白分析领域，具体涉及一种单细胞单管的样品处理及其单细胞蛋白质组学分析方法。

背景技术

蛋白质组学是后基因组计划之一，也是近年来的热点研究领域。作为生命体内功能直接执行者的蛋白质，和基因相比在揭示生命发育和疾病的发生发展的机制方面有更重大的意义。

近年来，基于细胞群体内的蛋白质组学研究，因为不可避免地会将大量细胞内的信息平均化，已经越来越难以满足对生命功能更加深入探究的需要。从单细胞层面去了解细胞特征以及彼此之间的相互影响，可以为生物系统中细胞间的异质性提供更宝贵的信息，因此有着越来越大的迫切需求。鉴于蛋白质不具有直接扩增的特性，以及蛋白质组学分析灵敏度的限制，目前对于少量乃至单细胞内蛋白质的检测在技术上还是极具挑战的。单细胞蛋白质组学分析的最大难点是样品量极少，单个细胞(如单个人体细胞)的蛋白约为100-200pg，并且在处理过程中细胞蛋白质因吸附在测试管内壁发生蛋白质的丢失，给样品前处理带来极大的困难。常规的蛋白质组样品前处理方法仅适用于大量细胞样品处理，适用常规反应体系时酶解效率低,当样品浓度很低(单细胞样品时)，此时酶解效率也会随之降低，所以迫切需要发展创新一系列技术来解决这个问题。目前还没有十分成熟的单细胞蛋白质组学分析方法，我们提出的这种基于单管处理的蛋白质组学样品处理方法简单、易操作、普适性强，实用性好。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便的单细胞蛋白质组学研究的单管样品处理方法。旨在避免单细胞蛋白信息丢失，改善单细胞蛋白质组学分析的效果。

本发明的第二目的在于，通过将样品处理方法与标准液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)平台相结合，形成了一套单细胞蛋白质组学方法。

一种基于单管处理的单细胞蛋白质组学分析样品制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：采用十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)对测试管内壁进行预处理；

步骤(2)：向预处理后的测试管中加入待测定的单细胞；利用单管处理方式，在该测试管中对单细胞进行细胞裂解，蛋白酶解处理，在所述的测试管中获得肽段待测溶液。

单细胞中的蛋白信息少，处理过程中极易丢失，影响结果分析，这是导致单细胞蛋白质组学分析需要依赖高昂设备，阻碍其大范围推广应用的主要因素。为解决单细胞蛋白质组学分析中容易存在蛋白丢失问题，本发明创新地采用十二烷基-β-D-麦芽糖苷对测试管内壁进行预处理，并进一步配合单管样品制备方式，直接在该预处理后的测试管中完成单细胞蛋白裂解的整个过程，并直接将其进行进样分析。本发明研究发现，通过本发明所述的十二烷基-β-D- 麦芽糖苷的预处理以及单管样品制备方式的联合，能够有效降低单细胞蛋白的丢失问题，能够改善单细胞蛋白质组学研究的准确性和分析的回收率和准确性。

本发明提供了一种简便，实惠，高效单细胞蛋白质组学技术。对于医学相关领域，单细胞蛋白质组学应用前景也十分广阔，先进及高效的方法能够帮助我们更好的服务于临床工作之中。

本发明中，通过所述的预处理，在所述的测试管的内壁形成十二烷基-β-D-麦芽糖苷薄膜。

本发明中，步骤(1)的预处理步骤为：向测试管中添加十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液，浸泡后倒出溶液，并干燥(例如自然干燥)。