[发明专利]一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法

权利要求书

1.一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以SNT70为表达载体，分别构建抗CD20抗体的表达质粒、抗CD3抗体的表达质粒；将抗CD20抗体的表达质粒、抗CD3抗体的表达质粒转染至宿主细胞中，得到目的细胞株；

(2)培养步骤(1)所述的目的细胞株并进行纯化，得到抗CD20×CD3双特异性抗体。

2.如权利要求1所述的一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法，其特征在于，目的细胞株的具体制备方法为：以SNT70为表达载体，分别将抗CD20抗体的基因和抗CD3抗体的基因连接到SNT70载体上，并同时分别转染至宿主细胞中，经过克隆挑选后得到目的细胞株。

3.如权利要求2所述的一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法，其特征在于，将制得的目的细胞株进行培养，分别得到抗CD20抗体、抗CD3抗体，然后将抗CD20抗体、抗CD3抗体以摩尔比为1:1的比例混合，并添加精氨酸和还原性谷胱甘肽至抗CD20抗体、抗CD3抗体的终浓度分别为10～200mM和60～140mM，用Tris调节pH至7.5～8.5，37℃下孵育3～5小时，然后进行纯化，制得双特异性抗体。

4.如权利要求1所述的一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法，其特征在于，目的细胞株的具体制备方法为：以SNT70为表达载体，分别将抗CD20抗体的基因和抗CD3抗体的基因连接到SNT70载体上，并同时一起转染至宿主细胞中，经过克隆挑选后得到目的细胞株。

5.如权利要求1所述的一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，培养目的细胞株的方法具体为：将细胞按(1.0±0.3)×10⁶cells/ml的接种密度稀释至细胞培养反应器中，细胞培养反应器中装有基础培养基，设置搅拌转速为250～280r/min，pH设置为6.95±0.15，通过碳酸氢钠溶液和CO₂调节pH；溶解氧设置为40±20％；培养过程中，第1～4天的温度设置为36.5±0.5℃；第5天降温至33.5±0.5℃；第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料；在培养过程中当葡萄糖浓度低于2.0～3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至4.0～5.0g/L。

6.如权利要求5所述的一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法，其特征在于，所述基础培养基是DynamisAGT 24.8g/L。

7.如权利要求5所述的一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法，其特征在于，所述补料培养基包括补料培养基A和补料培养基B；所述补料培养基A为CHO CDEfficientFeedA；所述补料培养基B为CHO CD EfficientFeed B；在补料时，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％。

8.如权利要求5所述的一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法，其特征在于，所述葡萄糖浓缩液的浓度为198～203g/L；所述碳酸氢钠溶液的浓度为90.5～91.1g/L。

9.如权利要求1所述的一种双特异性抗体细胞株的构建和筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述纯化的过程具体为：将细胞培养反应器中的培养上清液进行深层过滤去除细胞，得到滤液，并采用GE Mabselected Sure填料亲和纯化；然后采用Fractogel SO₃填料进行进一步的纯化去除单体，制得纯化的抗CD20×CD3双特异性抗体。

10.如权利要求1～9任一所述的构建和筛选方法制备得到的双特异性抗体细胞株。