[发明专利]一种利用钩藤不定芽诱导四倍体植株的方法

说明书

本发明涉及一种中药材的多倍体培养方法，具体为一种利用钩藤不定芽诱导四倍体植株的方法，依次通过不定芽的无菌培养、多倍体诱导、嵌合体分离培养、四倍体筛选、四倍体扩增以及四倍体生根步骤实现，本发明采用了独特的多倍体诱导液、嵌合体分离培养培养基、增殖培养基及生根培养基，本方法的钩藤四倍体诱导率为18%，经90~180天即可获得大量四倍体钩藤种苗，种苗在形态上根、茎、叶均明显增粗增厚，经栽植后植株明显矮化，植株的抗旱抗逆能力显著提升，药材亩产量提高50~100%，钩藤总碱含量较原母种提高0.12%。

技术领域

本发明涉及一种中药材的多倍体培养方法，属于植物作物育种及中药材种植领域，特别涉及钩藤的多倍体培养方法。

背景技术

钩藤（ Uncaria rhynchophylla（Miq.）Miq. ex Havil.）为茜草科钩藤属属多年生木质藤本植物，以带钩茎枝入药，有熄风定惊，清热平肝的功效，主要用于肝风内动，惊痫抽搐，高热惊厥，小儿惊啼，妊娠子痫，头疼眩晕等症。现代医药研究其内含钩藤碱，有降血压、抗血小板凝聚和抗血栓的功效，用于治疗部分心脑血管疾病。目前以钩藤为原料药的中药制剂约170余种，药材年需求量大。野生主要分布于云南、广东、广西、贵州、福建、湖南、湖北、江西等地，云南产地生于海拔1300~1900m的山谷溪边的疏林或灌木丛中。目前贵州、广西已形成一定规模种植。近年来，随着其开发用途的增加以及疗效的临床认可度提高，需求量逐年上升，钩藤药材价格亦随之上升，目前的种植规模产能已不能满足市场需求。传统的繁殖方式主要有种子繁殖和扦插繁殖，种子繁殖存在繁殖周期长、种质性状不稳定等缺点，而扦插繁殖具有繁殖率低，种苗及种植过程中病虫害严重等缺点。同时，钩藤在各企业药材标准中大部分有钩藤碱含量检测指标，由于钩藤品种较多，即使同种不同品种间差异亦较大，使得药材质量参差不齐。

多倍体是普遍存在于自然界中，是生物自身体细胞中具有三个或三个以上的染色体，常见于高等植物中，许多植物在进化的过程都经历了“多倍体化”与“二倍体化”。由于多倍体具有营养器官巨大性、抗逆性增强、生长率提高、有效成分含量增加等特点，因此，多倍体是作物育种的重要方式，亦是药用植物育种的重要方向，目前许多重要的粮食作物和经济作物都是多倍体。自然界中虽然多倍体广泛存在，但数量有限，而通过人工诱导，可以在短期内大量扩增。目前人工诱导多倍体的方式主要有化学诱导、物理诱导，其中以化学诱导因其操作简便、专一性强等优点，是最为有效且应用最为广泛的方法。

一方面钩藤中所含有效成分钩藤碱是钩藤内含成分应用最为广泛的物质，其含量也是国家以及企业检测钩藤药材是否达标的最重要指标，同时，钩藤碱含量越高，其药材价格以及价值也越大。另一方面，钩藤一般以钩为单位采收，而按目前钩藤的种植参数，钩藤亩产钩量仅为40~80千克，产量较低，制约了钩藤产业的发展。

发明内容

本发明针对上述现有钩藤种植产业的不足，利用现代作物育种及生物技术，对钩藤进行染色体加倍，获得钩藤四倍体，增加了钩藤单位面积产量以及药用价值。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1、无菌不定芽的培养：

（1）选取健壮、无病虫害钩藤幼嫩芽，用饱和肥皂水溶液涮洗10~15min，后用自来水冲洗3-4次至无肥皂液残留，加适量水，再加2~3滴吐温-80，振摇10~15min，用自来水冲淋50~60min；

（2）转移至超净工作台内，加入75%酒精振摇15~20s，无菌水涮洗3~4次，再加入0.1%升汞溶液振摇5~7min，无菌水涮洗6~8次，用无菌纸吸去外植体表面水分；

（3）将消毒完成幼嫩芽，接种于1/2MS+NAA 0.1~0.5mg/L+BA3.0~5.0mg/L的诱导培养基中，在温度23~27℃，光照强度1000~2000lux，单日光照时间10h的环境下培养20~30天。

2、不定芽的多倍体诱导：