[发明专利]遗传改造枯草芽孢杆菌的方法及其获得的菌株和应用

权利要求书

1.遗传改造枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(一)出发菌株MK3-MEP123-ΔdhbB的构建

(1)在B.subtilis染色体的yxlA位点过表达menA基因

首先以B.subtilis 168的染色体为模板，分别用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-U2q，yxlA-menA-1q/yxlA-menA-2，yxlA-menA-D1q/yxlA-menA-D2，yxlA-menA-G1q/yxlA-menA-G2扩增片段U(1115bp)、A(1057bp)、D(1053bp)、G(806bp)；以质粒pUC57-1.8k-P1为模板，用引物yxlA-menA-P1/yxlA-menA-P2扩增含有启动子P_lapS的片段P(442bp)；以BS168NUm的染色体为模板，用引物yxlA-menA-CR1q/CR2扩增片段CR(2069bp)；然后通过重叠PCR方法，利用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-2，将片段U、P和A拼接成片段UPA(2614bp)；再利用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-D2将片段UPA和片段D拼接成片段UPAD(3667bp)；最后利用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-G2将片段UPAD、片段CR和片段G拼接成片段UPADCRG(6542bp)；将UPADCRG片段转化受体菌BS168NU的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得menA基因在yxlA位点整合的重组菌株MK3；

(2)在B.subtilis染色体的yjoB位点过表达dxs基因

首先以B.subtilis 168的染色体为模板，分别用引物yjoB-dxs-U1/yjoB-dxs-U2q，yjoB-dxs-1q/yjoB-dxs-2，yjoB-dxs-D1q/yjoB-dxs-D2，yjoB-dxs-G1q/yjoB-dxs-G2扩增片段U(1236bp)、s(1947bp)、D(808bp)、G(697bp)；以质粒pUC57-1.8k-P2为模板，用引物P₄₃1/P₄₃2扩增含有启动子P₄₃的片段P(232bp)；以BS168NUm的染色体为模板，用引物yjoB-dxs-CR1q/CR2扩增片段CR(2069bp)；然后通过重叠PCR方法，利用引物yjoB-dxs-U1/yjoB-dxs-2，将片段U、P和s拼接成片段UPs(3415bp)；再利用引物yjoB-dxs-U1/yjoB-dxs-D2将片段UPs和片段D拼接成片段UPsD(4223bp)；最后利用引物yjoB-dxs-U1/yjoB-dxs-G2将片段UPsD、片段CR和片段G拼接成片段UPsDCRG(6989bp)；将UPsDCRG片段转化受体菌MK3的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得dxs基因在yjoB位点整合的重组菌株MK3-MEP1；

在菌株MK3-MEP1的基础上，依次过表达dxr和yacM-yacN，得到重组菌株MK3-MEP123；以B.subtilis 168的染色体为模板，分别用引物dhbB-U1/dhbB-U2、dhbB-D1q/dhbB-D2和dhbB-G1q/dhbB-G2扩增片段U(1003bp)、D(815bp)和G(605bp)；以中间菌BS168NUm的染色体为模板，用引物dhbB-CR1q/CR2扩增带有选择盒(cat-araR)的片段CR(2069bp)；首先通过重叠PCR，利用引物dhbB-U1/dhbB-D2，将片段U和D拼接成UD(1818bp)；然后利用引物dhbB-U1/dhbB-G2，通过重叠PCR方法，将上述三个片段UD、GR和G拼接成UDCRG(4492bp)；将UDCRG片段转化受体菌MK3-MEP123的感受态细胞，最终筛选获得基因dhbB被敲除的重组菌株MK3-MEP123-ΔdhbB；

(二)过表达甘油激酶基因glpK和甘油-3-磷酸脱氢酶基因glpD

glpK过表达菌株的构建；首先以出发菌B.subtilis MK3-MEP123-ΔdhbB的染色体为模板，分别用引物pksJ-glpK-U1/pksJ-glpK-U2q、pksJ-glpK-1q/pksJ-glpK-2、pksJ-glpK-D1q/pksJ-glpK-D2和pksJ-glpK-G1q/pksJ-glpK-G2扩增片段U，如SEQ ID No.36所示，1164bp，扩增片段K如SEQ ID No.37所示，1783bp；扩增片段D如SEQ ID No.38所示，948bp；扩增片段G如SEQ ID No.39所示，990bp；以BS168NUm的染色体为模板，用引物pksJ-glpK-CR1q/CR2扩增片段CR，如SEQ ID No.40所示，2069bp；以质粒pUC57-1.8k-P1为模板，用引物P_lapS1/P_lapS2扩增含有启动子P_lapS表达盒的片段P，如SEQ ID No.41所示，256bp；然后通过重叠PCR方法，利用引物pksJ-glpK-U1/pksJ-glpK-2，将片段U、P和K拼接成片段UPK(3203bp)；再利用引物pksJ-glpK-U1/pksJ-glpK-D2将片段UPK和片段D拼接成片段UPKD(4151bp)；最后利用引物pksJ-glpK-U1/pksJ-glpK-G2将片段UPKD、片段CR和片段G拼接成片段UPKDCRG(7210bp)；将UPKDCRG片段转化受体菌MK3-MEP123-ΔdhbB的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得glpK基因在pksJ位点整合的重组菌株BSMK_1；UPKDCRG片段序列如SEQ ID No.42所示；

glpD过表达菌株的构建；首先以出发菌B.subtilis MK3-MEP123-ΔdhbB的染色体为模板，分别用引物pksL-glpD-U1/pksL-glpD-U2q、pksL-glpD-1q/pksL-glpD-2、pksL-glpD-D1q/pksL-glpD-D2和pksL-glpD-G1q/pksL-glpD-G2扩增片段U，如SEQ ID No.43所示，1118bp；扩增片段D如SEQ ID No.44所示，1749bp；扩增片段D如SEQ ID No.45所示，1004bp；扩增片段G如SEQ ID No.46所示，769bp；以BS168NUm的染色体为模板，用引物pksL-glpD-CR1q/CR2扩增片段CR，如SEQ ID No.40所示，2069bp；以质粒pUC57-1.8k-P1为模板，用引物P_lapS1/P_lapS2扩增含有启动子P_lapS表达盒的片段P，如SEQ ID No.41所示，256bp；然后通过重叠PCR方法，利用引物pksL-glpD-U1/pksL-glpD-2，将片段U、P和D拼接成片段UPD(3123bp)；再利用引物pksL-glpD-U1/pksL-glpD-D2将片段UPD和片段D拼接成片段UPDD(4127bp)；最后利用引物pksL-glpD-U1/pksL-glpD-G2将片段UPDD、片段CR和片段G拼接成片段UPDDCRG(6965bp)；将UPDDCRG片段转化受体菌BSMK_1的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得glpD基因在pksL位点整合的重组菌株BSMK_2；UPDDCRG片段序列(如SEQ ID No.47所示)；

(三)敲除丙酮醛合成酶编码基因mgsA和甘油-1-磷酸脱氢酶编码基因araM

以出发菌B.subtilis MK3-MEP123-ΔdhbB的染色体为模板，分别用引物mgsA-U1/mgsA-U2、mgsA-D1q/mgsA-D2和mgsA-G1q/mgsA-G2扩增片段U，如SEQ ID No.48所示，1382bp；扩增片段D如SEQ ID No.49所示，1130bp；扩增片段G如SEQ ID No.50所示，813bp；以BS168NUm的染色体为模板，用引物mgsA-CR1q/CR2扩增带有选择盒(cat-araR)的片段CR，如SEQ ID No.40所示，2069bp；首先通过重叠PCR，利用引物mgsA-U1/mgsA-D2，将片段U和D拼接成UD(2512bp)；然后利用引物mgsA-U1/mgsA-G2，通过重叠PCR方法，将上述三个片段UD、GR和G拼接成UDCRG(5394bp)；将UDCRG片段转化受体菌BSMK_2的感受态细胞，最终筛选获得基因mgsA被敲除的重组菌株BSMK_3；UDCRG片段序列如SEQ ID No.51所示；

以出发菌B.subtilis MK3-MEP123-ΔdhbB的染色体为模板，分别用引物araM-U1/araM-U2、araM-D1q/araM-D2和araM-G1q/araM-G2扩增片段U，如SEQ ID No.52所示，1487bp；扩增片段D如SEQ ID No.53所示，1026bp；扩增片段G如SEQ ID No.54所示，682bp；以BS168NUm的染色体为模板，用引物araM-CR1q/CR2扩增片段CR，如SEQ ID No.40所示，2069bp；首先通过重叠PCR，利用引物araM-U1/araM-D2，将片段U和D拼接成UD(2513bp)；然后利用引物araM-U1/araM-G2，通过重叠PCR方法，将上述三个片段UD、GR和G拼接成UDCRG(5264bp)；将UDCRG片段转化受体菌BSMK_3的感受态细胞，最终筛选获得基因araM被敲除的重组菌株BSMK_4；UDCRG片段序列如SEQ ID No.55所示；

引物序列如下

2.权利要求1获得的菌株在发酵制备甲基萘醌-7上的应用。