[发明专利]用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的特异性PCR引物

说明书

本发明公开了一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的特异性PCR引物，本发明首先通过对山羊支原体山羊肺炎亚种基因测序和对比，筛选到用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的靶序列，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，然后设计了检测其的特异性PCR引物，可将Mccp与丝状支原体簇其他成员以及常见反刍动物支原体区分开，显示出良好的特异性，可作为新诊断靶标，以此为基础建立更具临床实用性的Mccp诊断技术。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的特异性PCR引物。

背景技术

山羊传染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)是由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)引起的一类具有高度传染性的山羊呼吸道疾病，发病率80％～100％，死亡率60％～80％，是OIE法定报告疫病之一。全世界范围内超过40个国家的山羊产业受到CCPP的威胁，我国于1922年首次在新疆报道山羊“烂肺病”，其后广泛流行于西北、华北等地，曾通过应用组织灭活疫苗得到较好控制，但近年来病例报道增多，呈卷土重来之势，控制难度增大。

CCPP病原Mccp属于丝状支原体簇，除了Mccp外，该簇成员还包括：丝状支原体丝状亚种(M.mycoides subsp.mycoides,Mmm)，丝状支原体山羊亚种(M.mycoidessubsp.capri,Mmc)，山羊支原体山羊亚种(M.capricolumsubsp.Capricolum,Mcc)，李奇氏支原体(M.Leachii,Ml)。除了Mccp能够引起羊肺炎外，Mmc和绵羊肺炎支原体(M.ovipneumoniae，Mo)也是临床上常见的羊肺炎病原体。由于丝状支原体簇成员具有高度的血清学和基因组学相似性，所以要求CCPP诊断方法具有极高的特异性。Mccp常用的血清学诊断方法ELISA、IHA、CFT等存在非特异性以及检测成本高的问题，对于此问题，由于核酸分子诊断技术具有更好的特异性以及敏感性，一定程度上可弥补这些不足。

目前已报道的核酸分子诊断技术主要是基于特异性基因建立的PCR体系，或利用已经普及的测序技术进行病原鉴定。现有的核酸诊断方法包括普通PCR、q-PCR、聚合酶链式-限制酶切分析(PCR-REA)、环介导恒温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)和重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)系统，主要是基于Mccp特异性基因16S rRNA，H2，arcD设计引物/探针。随着技术的不断改进，这些核酸诊断方法具有良好的特异性以及敏感性，但一方面大部分的扩增系统都是基于DNA样本，需要专业的实验室设备；而其中无需提取DNA和专业实验设备的RPA技术检测成本却高达80元/样，这很大程度的降低了核酸诊断方法检测Mccp的临床实用性。

发明内容

针对上述背景技术中指出的不足，本发明提供了一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的特异性PCR引物，可将Mccp与丝状支原体簇其他成员以及常见反刍动物支原体区分开，可作为新诊断靶标，以此为基础建立更具临床实用性的Mccp诊断技术。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

通过比较基因组学获得一些Mccp特异性序列，通过Primer 5软件针对这些序列设计引物，根据得分情况，最终在上述Mccp特异性序列中选择SEQ ID NO.1所示的序列作为PCR检测靶序列。

本发明设计的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)的特异性PCR引物的基因序列如下：

92.1R：5'-TTTACTGACTTGGGTGTTAGG-3'；

92.1F：5'-ATAAGTTGGAAGAAGATAATGCT-3'；