[发明专利]optrA耐药蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体5C6的酶标板、检测抗体2F3-HRP、optrA蛋白标准品。

2.根据权利要求1所述的检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：

所述捕获抗体5C6和检测抗体2F3为采用optrA重组蛋白免疫小鼠，经融合、克隆、筛选，得到的。

3.根据权利要求1或2所述的检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：

所述单克隆抗体5C6的重链可变区的氨基酸序列为序列2；

所述单克隆抗体5C6的轻链可变区的氨基酸序列为序列3；

所述单克隆抗体2F3的重链可变区的氨基酸序列为序列4；

所述单克隆抗体2F3的轻链可变区的氨基酸序列为序列5。

4.根据权利要求2所述的检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：

PCR扩增目的片段并克隆至表达载体pET28a，将成功构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，经亲和层析和分子筛层析高度纯化后得到optrA、重组蛋白。

5.根据权利要求4所述的检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，重组optrA蛋白氨基酸序列为序列1。

6.根据权利要求1所述的检测optrA耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体2F3-HRP制备步骤包括：

（1）称取5 mg HRP溶于1 mL三蒸水中，逐滴缓慢加入0.20 mL新配的0.1 M NaIO₄溶液，4℃避光搅拌25 min，活化HRP，颜色由棕色变为绿色；上述溶液装入透析袋中，用1 M，pH为4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，10000 r/min，4℃，10 min，离心去除沉淀；得到透析后的HRP；

（2）将单克隆抗体5C6抗体用0.2 M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到透析后的抗体；

（3）将透析后的HRP加入0.16 M乙二醇（每mg酶加0.1 mL），4℃避光搅拌1 h，然后加入透析后的抗体；两者混匀后用0.05 M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到HRP-抗体混合液；

（4）对0.15 M pH 7.4 PBS透析过夜；搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸氨，4℃避光搅拌3 h；4℃，10000 rpm离心15 min，弃上清；PBS溶解沉淀，得到经辣根过氧化物酶标记的检测抗体2F3-HRP，使用酶标记物稀释液1:30000倍稀释后备用。

7.一种制备权利要求1-6中任一所述的试剂盒的方法，包括如下步骤：

1）包被有单克隆抗体5C6的酶标板的制备：将单克隆抗体5C6用碳酸盐缓冲液稀释成浓度为5 μg/mL的抗体包被液，每孔100 μL，4℃包被过夜后洗板；然后每孔加入100 μL封闭液，37℃、湿度30-40%封闭2 h，37℃、湿度30-40%恒温干燥2 h；

2）检测抗体稀释液：0.01 M pH7.4的PBST溶液；

3）检测抗体工作液的制备：检测抗体2F3-HRP按照 1:30000比例稀释后备用；

4）样品稀释液的制备：0.01 M pH 7.4的PBS溶液；

5）底物A液的制备：含0.08%过氧化脲、0.025%PEG-2000、3.58%十二水合磷酸氢二钠、0.96%一水合柠檬酸水溶液，调pH值至7.4；

6）底物B液的制备：含1.03%一水合柠檬酸、0.04% TMB、0.0008%硫代硫酸钠、0.1%光稳定剂292、3% DMF水溶液，调pH值至5.0。