[发明专利]禽致病性大肠杆菌clbH基因缺失株及其构建方法和应用

权利要求书

1.禽致病性大肠杆菌clbH基因缺失株，其特征在于，为敲除了clbH基因的禽致病性大肠杆菌株。

2.权利要求1所述的禽致病性大肠杆菌clbH基因缺失株的构建方法，其特征在于，利用Red同源重组系统构建APEC TW-XM菌株的clbH基因缺失株，获得缺失株APEC△clbH；包括：

S1、引物设计

根据GenBank中APEC TW-XM菌株基因组CP025328.1已知的clbH基因序列设计引物P1/P2，用于鉴定基因clbH；P1序列如SEQ ID NO.1所示；P2序列如SEQ ID NO.2所示；

设计一对同源重组引物P3/P4，使其5’端与clbH双翼序列同源，3’端与质粒pKD3中氯霉素抗性基因Cat双侧序列同源；P3序列如SEQ ID NO.3所示；P4序列如SEQ ID NO.4所示；

S2、融合PCR产物的制备

以质粒pKD3为模板，P3/P4为引物，根据引物条件进行PCR，扩增出两翼为clbH基因上下游同源序列，中间为Cat氯霉素抗性基因的DNA片段；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后采用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化，得到纯化PCR产物；

S3、Red重组功能的诱导和感受态细胞的制备

将携带有质粒pKD46的APECTW-XM接种于含有L-阿拉伯糖的LB培养基中，诱导培养，使pKD46中的Exo、Bet及Gam蛋白充分表达；将APEC TW-XM制备成感受态细胞；

S4、一次同源重组菌的构建及PCR鉴定

将S2中得到的纯化PCR产物与S3中制备的感受态细胞混匀，加入到电击杯中，进行电击转化；将转化产物涂布于含有Amp和Cm抗性的LB平板，30 ℃倒置培养过夜；次日挑取单菌落制备模板，以P1/P2为引物进行PCR鉴定，筛选获得clbH基因一次同源重组菌APEC△clbH::Cat；

S5、二次同源重组菌的构建与鉴定

将质粒pCP20电转入重组菌APEC△clbH::Cat，转化产物涂布于Amp和Cm双抗性LB平板，30℃倒置培养筛选阳性转化子；将阳性转化子转接于无抗性LB培养基，42℃传代培养2~3代，平板划线分离单菌落，37℃静置培养过夜；对多个单菌落分别进行Amp和Cm抗性检测，筛选出对两者均敏感的菌株；以P1/P2为引物进行PCR，经PCR鉴定，获得禽致病性大肠杆菌clbH基因缺失株APEC△clbH。

3.根据权利要求2所述的禽致病性大肠杆菌clbH基因缺失株的构建方法，其特征在于，S2中，PCR程序为94℃4min；94℃30 s，52℃60 s，72℃60 s，10个循环；94℃30 s，63℃60 s，72℃60 s，25个循环；最后72℃延伸10min。

4.根据权利要求2所述的禽致病性大肠杆菌clbH基因缺失株的构建方法，其特征在于，S4、S5中，PCR程序为94℃4min；94℃30s，57℃30 s，72℃30 s，25个循环；最后72℃延伸10min。

5.根据权利要求2所述的禽致病性大肠杆菌clbH基因缺失株的构建方法，其特征在于，S4中，在电压1.8 kV，脉冲25 μF，电阻200 Ω的参数下进行电击转化。