[发明专利]用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻及其构建方法、应用有效
申请号: | 202010186754.6 | 申请日: | 2020-03-17 |
公开(公告)号: | CN111454976B | 公开(公告)日: | 2022-11-01 |
发明(设计)人: | 娄素琳;胡章立;黄思敏;林鑫 | 申请(专利权)人: | 深圳大学 |
主分类号: | C12N15/61 | 分类号: | C12N15/61;C12N15/82;C12N15/66;C12N1/13;C12N9/90;C12R1/89 |
代理公司: | 深圳市君胜知识产权代理事务所(普通合伙) 44268 | 代理人: | 徐凯凯;刘芙蓉 |
地址: | 518060 广东*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 用于 提高 莱茵衣藻 叶黄素 含量 转基因 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法,其特征在于,其包括:
扩增得到普通小球藻的番茄红素ε-环化酶基因,构建所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体;
将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中,得到转番茄红素ε-环化酶基因莱茵衣藻;
所述番茄红素ε-环化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述构建所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体,具体包括:
对番茄红素ε-环化酶-T载体、pH124空载体进行双酶切,得到目的片段番茄红素ε-环化酶基因和线性化质粒pH124;
将得到目的片段番茄红素ε-环化酶基因和线性化质粒pH124,用T4 DNA连接酶进行连接,连接反应结束后,将连接产物与大肠杆菌感受态细胞混合冰上放置,加入无抗LB培养基,摇床复苏,复苏菌液涂布氨苄青霉素抗性平板;倒置培养过夜,得到转化子;
对所述转化子用新抗性平板二筛,二筛后的转化子菌落进行PCR扩增,得到番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体;
所述将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中,得到转番茄红素ε-环化酶基因莱茵衣藻,包括:
将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体用限制性内切酶NotI进行单酶切使其线性化;将线性化番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中,得到转番茄红素ε-环化酶基因莱茵藻;
所述番茄红素ε-环化酶基因含7个外显子,6个内含子;
所述番茄红素ε-环化酶-T载体、pH124空载体进行双酶切的反应体系为:酶切buffer 2μL、Eco72I 1 μL、NheI 1μL、番茄红素ε-环化酶-T载体或pH124空载体 1 μg、无菌水 Up to20μL;
所述将得到目的片段番茄红素ε-环化酶基因和线性化质粒pH124,用T4 DNA连接酶进行连接,其中,连接体系为:番茄红素ε-环化酶基因与载体的摩尔比1:1-1:5、线性化质粒pH124 20-100 ng、10X T4 DNA Ligase Buffer 2 μL、T4 DNA Ligase 0.2 μL、无菌水 Upto 20μL。
2.根据权利要求 1 所述的用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法,其特征在于,所述番茄红素ε-环化酶基因为人工转化番茄红素ε-环化酶基因。
3.根据权利要求 1 所述的用于提高莱茵衣藻叶黄素含量的转基因衣藻的构建方法,其特征在于,所述将所述番茄红素ε-环化酶基因重组表达载体转化至莱茵衣藻细胞中,其中转化方法为珠磨法。
4.一种普通小球藻的番茄红素ε-环化酶,其特征在于,由番茄红素ε-环化酶基因编码得到,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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