[发明专利]一株高产岩藻糖基乳糖的酿酒酵母工程菌株及其应用

说明书

本发明公开了一种高产2’‑岩藻糖基乳糖的酿酒酵母工程菌株，通过代谢工程改造，使得酿酒酵母可以吸收乳糖并在胞内以GDP‑甘露糖为前体合成GDP‑岩藻糖，并通过异源表达来源于蜡样芽孢杆菌中的α‑1,2‑岩藻糖基转移酶，所得到的重组菌株可以高产2’‑岩藻糖基乳糖，为工业化生产2’‑岩藻糖基乳糖提供重要参考。

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一株高产岩藻糖基乳糖，尤其是高产2’-岩藻糖基乳糖的重组酿酒酵母及其应用。

背景技术

2’-岩藻糖基乳糖(2-FL)作为母乳寡糖中的重要组成部分，可以促进人体肠道内有益微生物如双歧杆菌等的生长，降低肠道内病原体感染的风险，还可以调控免疫应答。目前2-FL已在婴幼儿配方奶粉中作为添加剂使用。2-FL的大量合成具有良好的经济效益。化学合成2-FL过程中需添加有毒试剂，难以应用于食品工业。

在生物体内合成2-FL是行之有效的方法。2-FL的生物合成过程已较为清楚：一分子供体GDP-岩藻糖在α-1,2-岩藻糖基转移酶的作用下与受体乳糖结合，产生一分子2-FL。现有技术中有研究构建了高产2-FL的大肠杆菌重组菌株。但是大肠杆菌可能产生内毒素，影响产品的分离纯化难度及产品安全性；另外大肠杆菌发酵时易受到噬菌体的污染，这使大肠杆菌工业化生产2-FL受到了制约。

酿酒酵母是被普遍认为安全的微生物，已有研究利用酿酒酵母合成2-FL；但是，现有报道中酿酒酵母菌株合成的2-FL产量仅0.5g/L，难以满足工业化生产的需要。制约酿酒酵母中2-FL产量的重要因素之一为α-1,2-岩藻糖基转移酶的酶活性不足。寻找具有高活力的α-1,2-岩藻糖基转移酶可能会提高酿酒酵母中2-FL的产量。

发明内容

本发明通过代谢工程改造，使得酿酒酵母可以吸收乳糖并在胞内以GDP-甘露糖为前体合成GDP-岩藻糖，并通过异源表达来源于蜡样芽孢杆菌中的α-1,2-岩藻糖基转移酶，得到了高产2-FL的酿酒酵母工程菌株。

一方面，本发明提供了一株高产2’-岩藻糖基乳糖的酿酒酵母工程菌株，所述酿酒酵母工程菌株中含有重组的乳糖透性酶(Lactose permease)、重组的GDP-甘露糖脱水酶(GDP-mannose-4,6-dehydratase)、重组的GDP-岩藻糖合酶(GDP-L-fucose synthase)以及重组的α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2 fucosyltransferase)。

本发明中，术语“重组”指通过转化将目的基因转移到酿酒酵母中；所述含有重组的目的基因的酿酒酵母工程菌株与其来源的野生型酿酒酵母相比，其已经以遗传方式修饰，从而展示出改变的或不同的基因型和/或表型。可以通过将目的蛋白通过载体在宿主菌中进行表达(包括过表达的方式)来实现，还可以通过将目的蛋白的编码基因重组到宿主菌的基因组上来实现。

含有重组的目的基因的酿酒酵母工程菌株含有至少一个被引入的基因序列，此类基因序列包括但不限于天然存在或不存在酿酒酵母中的基因以及希望引入到酿酒酵母细胞中的其他基因或DNA序列，无论野生型的酿酒酵母中是否已经存在相同或类似的基因或DNA序列；在一些实施方式中，引入的基因序列将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替代内源基因或DNA序列；在其他的实施方式中，引入到酿酒酵母工程菌株中的重组基因可以是与存在酿酒酵母中的DNA序列相同的并且被引入以提供DNA的一个或多个另外的拷贝，从而DNA的基因产物过表达或修饰的表达。

在优选的实施方式中，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶来源于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，更优选的，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。

更优选的，所述酿酒酵母工程菌株包含重组的α-1,2-岩藻糖基转移酶的编码基因；优选的，所述编码基因的序列如SEQ ID No.12所示。

优选的，所述乳糖透性酶来源于乳酸克鲁维斯酵母，更优选的，所述乳糖透性酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。