[发明专利]构建包含大片段反向互补序列载体的方法在审
| 申请号： | 202010187451.6 | 申请日： | 2020-03-17 |
| 公开（公告）号： | CN111349638A | 公开（公告）日： | 2020-06-30 |
| 发明（设计）人： | 刘云;杨玲玲 | 申请（专利权）人： | 深圳市泽龙生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66 |
| 代理公司： | 深圳壹舟知识产权代理事务所(普通合伙) 44331 | 代理人： | 寇闯 |
| 地址： | 518000 广东省深圳市龙华区龙华*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 构建 包含 片段 反向 互补 序列 载体 方法 | ||
1.一种构建包含大片段反向互补序列的方法，其中反向互补序列跨度大于或等于100bp，反向互补序列同源性大于或等于50％，该方法包括以下步骤：
S1：序列分割：把目标序列分成两个无反向互补序列的片段：片段1，片段2，在每个片段的两端均设计为包含Type IIS酶切位点，合成这两个片段；
S2：酶切/连接反应：将片段1和片段2和/或克隆载体用type IIS内切酶进行酶切，然后用连接酶进行连接，得到连接产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶切和连接反应在同一反应体系中进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中还包括加热使酶失活的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中分解成两个无反向互补序列的片段中，分解位点位于两个反向互补序列之间任何两个相邻碱基位点之间。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切反应温度为25℃-58℃，连接反应温度为4℃-24℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
S3：转化：将步骤S2获得的包括克隆载体的连接产物转化至感受态细胞，将感受细胞在平板培养基中进行抗生素筛选。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中Type IIS酶是BsaI、BmsBI、BbsI或SpaI。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤S2中连接酶为T4连接酶。
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