[发明专利]一种假单胞菌及其应用

说明书

本发明涉及一种假单胞菌，属于微生物技术领域。所述假单胞菌为JDB001株，经质粒消除技术减毒，制作成微生物菌剂应用于水塘的鱼类养殖可大大提高鱼类的成活率。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种假单胞菌及其应用。

背景技术

假单胞菌，广泛分布于淡水、污水及土壤中，能引起多种水产养殖动物患病，特别是在现代大规模的集中化高密度鱼类养殖的环境下，鱼类极易感染细菌性疾病。鱼类在感染假单胞菌后，引起细菌性败血症，造成鱼类死亡，给鱼类水产养殖业带来巨大的生产损失。现有的鱼类养殖基本都是通过使用嗜水气单胞菌疫苗对鱼塘中的鱼苗进行疾病防治，但疫苗的投放无法做到让所有的鱼苗都能接种生效，仍然存在防治不彻底的现象。

质粒(Plasmid)是附加到细菌细胞中的非细胞染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子。有些质粒含有某种抗药基因；有一些质粒携带的基因则可以赋予细菌细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明专利设计了一种非致病性的假单胞菌，所述假单胞菌经质粒消除技术减毒为非致病菌，命名为假单胞菌JDB001株，建议分类命名为：假单胞菌(Pseudomonas sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为：2019年6月17日，保藏号为：CGMCCNo.17947。

假单胞菌JDB001株的质粒消除过程包括以下步骤：

a、质粒消除培养,按60ug/ml加入质粒消除剂(十二烷基硫酸钠)配制营养肉汤培养基，接种假单胞菌，并于摇床41℃环境下培养46小时；

b、无质粒菌落挑选，将上述培养物利用营养琼脂平板培养基划线分离，37℃培养8-12小时，挑取20单个菌落，分别接种于5mL肉汤培养基中，并于摇床上37℃环境下培养8-12小时；

c、提取质粒，利用大质粒提取法检测上述营养肉汤培养的细菌中是否存在质粒；

d、保留菌种，将不含质粒的假单胞菌，接种琼脂斜面培养基，37℃培养8-12小时；

e、培养完毕后，将菌种于4℃冰箱保存。

同时，本发明专利还设计了上述的假单胞菌在鱼塘养殖中的应用。其应用步骤包括，

a、菌种扩增：配制液体肉汤培养基10000ml，分装至数支5ml试管、数个250三角烧瓶、1000ml三角烧瓶，于120℃灭菌30分钟；

取少许无质粒减毒假假单胞菌JDB001株原始菌种，接种于盛有液体肉汤培养基5ml试管，于数显恒温水浴振荡器28℃振摇8-12小时，于4℃冰箱保存，作为试管生产菌种；

取一支试管生产菌种，接种到盛有液体肉汤培养的250ml三角烧瓶中，于数显恒温水浴振荡器28℃振摇8-12小时，作为三角瓶菌种；

将三角瓶菌种按5％的体积比接种到盛有液体肉汤培养的1000ml三角烧瓶中，于数显恒温水浴振荡器28℃振摇8-12小时，获得含有假单胞菌JDB001的微生物菌剂，后于4℃冰箱保存；

以上述方法扩增10L微生物菌剂；

b、将10L微生物菌剂加入到100L含5％红糖的水溶液中，培养4-8小时；

c、按照1L/亩的用量，将上述水溶液加入到鱼塘中，进行养水，养水时间为2-3周，之后放入鱼苗。