[发明专利]一种高产胞苷的大肠杆菌突变株以及发酵生产胞苷的方法

说明书

本发明涉及一种高产胞苷的大肠杆菌突变株以及发酵生产胞苷的方法，属于发酵技术领域，该大肠杆菌突变株是通过诱变筛选获得的，其具有如下特征：①氨甲酰磷酸合成酶182位的丙氨酸突变为缬氨酸，948位的丝氨酸突变为苯丙氨酸；②天冬氨酸氨甲酰转移酶调节亚基86位的异亮氨酸、93位的甘氨酸、109位的半胱氨酸缺失；③尿苷酸激酶72位的天冬酰胺突变为丙氨酸，159位的天冬氨酸突变为天冬酰胺；④胞苷三磷酸合成酶147位天冬氨酸突变为谷氨酸，149位谷氨酸突变为丙氨酸。该突变株在50 L发酵罐中经过发酵，胞苷产量达到90±2 g/L，糖酸转化率可达30±1%，均为现有报道的最高值。

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体地，涉及一种高产胞苷的大肠杆菌突变株以及发酵生产胞苷的方法。

背景技术

胞苷是合成核糖核酸与脱氧核糖核酸的前体物质，参与了许多生命体内的反应。胞苷是重要的医药合成中间体，可以用来合成扎西他滨、卡培他滨、环胞苷、阿糖胞苷、阿扎胞苷、盐酸阿糖胞苷等抗病毒与抗肿瘤药物。因此，开发大批量、工业化、低成本高效的胞苷生产方法，满足医药领域对于胞苷原料的需求是一个重要的问题。

生物发酵法合成胞苷主要依赖于微生物的发酵作用，所以生物发酵所选用的微生物种类就显得至关重要。自然条件下能够合成胞苷的菌株主要来源于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，但是胞苷合成量很低且无法控制。采用传统诱变或分子生物学方法可以提高菌株的胞苷生产能力。日本在胞苷合成菌种的培育上取得了较多成果，成功培育出了具有胞苷脱氨酶缺失、3-脱杂氮尿嘧啶抗性、5-氟胞苷抗性、氨甲酰磷酸合成酶活力增强以及高丝氨酸脱氢酶活力缺失等特性的枯草芽孢杆菌突变株，其最大胞苷产率稳定在30g/L左右(Bioscience,biotechnology,and biochemistry,1996,60(2):353-354.)。国内在胞苷菌株选育方面也开始了相关工作，通过对大肠杆菌胞苷合成途径进行代谢工程改造，在5L发酵罐中实现了20g/L的胞苷产量(CN2017100038337)。

胞苷高产菌株的选育难点在于解除氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸氨甲酰转移酶、尿苷酸激酶、胞苷三磷酸合成酶受到的反馈调控。虽然通过酶的高级结构分析可以预测代谢物与酶的结合位点，但是与反馈调控相关的氨基酸位点却并不清楚。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供一种高产胞苷的大肠杆菌突变株，目的二在于提供利用所述大肠杆菌突变株发酵生产胞苷的方法。所述大肠杆菌突变株解除了氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸氨甲酰转移酶、尿苷酸激酶、胞苷三磷酸合成酶受到的反馈调控，用于胞苷生产后，在50L发酵罐中的胞苷产量达到90±2g/L，较现有技术具有明显的提高。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种高产胞苷的大肠杆菌突变株，所述大肠杆菌突变株具有如下特征：1、氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的氨甲酰磷酸合成酶大亚基的第182位的丙氨酸突变为缬氨酸、第948位的丝氨酸突变为苯丙氨酸；2、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的天冬氨酸氨甲酰转移酶调节亚基第86位的异亮氨酸、第93位的甘氨酸和第109位的半胱氨酸缺失；3、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的尿苷酸激酶第72位的天冬酰胺突变为丙氨酸、第159位的天冬氨酸突变为天冬酰胺；4、氨基酸序列如SEQ ID No.13所示的胞苷三磷酸合酶第147位天冬氨酸突变为谷氨酸、第149位谷氨酸突变为丙氨酸。

作为对上述方案的进一步优化，所述大肠杆菌突变株，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.19117，保藏日期为2019年12月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。