[发明专利]一种多重PCR_SNP基因分型检测方法

说明书

本发明属于基因分型检测技术领域，公开了一种多重PCR_SNP基因分型检测方法，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法包括：引物设计；组织、细胞及血样DNA提取；PCR扩增；PCR产物纯化；单碱基延伸；树脂纯化：每个延伸反应产物用6mg Clean Resin树脂纯化；芯片点样及质谱检测。本发明提供的多重PCR_SNP基因分型检测方法表明，在65个分型位点中，无信息量及分型成功率小于95％的位点为6个，占9.23％；MAF偏低SNP位点为6个，占9.23％；HWE检验p1e‑2的SNP位点为7个，占10.77％；最终所用的有效SNP位点为59个，占90.77％。

技术领域

本发明属于基因分型检测技术领域，尤其涉及一种多重PCR_SNP基因分型检测方法。

背景技术

目前，最接近的现有技术：聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)的顺利进行是以模板单链与引物链按照碱基配对原则正确配对为前提。所以，在包含碱基差异的区域，设计一组只有单碱基差异的PCR引物，利用常见的PCR扩增仪，进行扩增，检测是否有符合设计片段长度的扩增产物产生，可以判断目标区域靶位点的碱基类型。但在使用常规PCR引物时，即使存在单碱基的错配，PCR反应有时也可以正常进行，得到与目的片段长度相同的扩增产物。因而使用常规引物进行PCR扩增分型时，无法排除假阳性结果，进而可能会得到错误的基因型分型结果。

目前，常用的SNP位点基因型检测方法主要有测序法、芯片法以及质谱法等，其中测序法价格比较昂贵，而芯片法和质谱法只有在同时测定多个位点或研究大群体样品时较有优势，且这三种方法都必须以相关的大型仪器平台作为支撑，存在多种局限。因此，亟需一种新的多重PCR_SNP基因分型检测方法，以弥补现有技术缺陷。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有SNP位点基因型检测方法中，测序法价格比较昂贵，而芯片法和质谱法只有在同时测定多个位点或研究大群体样品时较有优势，且这三种方法都必须以相关的大型仪器平台作为支撑，存在多种局限。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种多重PCR_SNP基因分型检测方法。

本发明是这样实现的，一种多重PCR_SNP基因分型检测方法，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法PCR扩增时，引物的3`端碱基跟模板完全匹配时，DNA聚合酶进行延伸反应，检测信号就强；如果引物的3`端碱基跟模板不匹配，检测信号就弱；根据等位基因的基因型的不同设计不同的引物，将不同的等位基因区分开，在不同等位基因的引物5端各自连上一段不同的tag序列，序列能与芯片上点制的tag序列杂交，实现对基因型的判读。

进一步，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法的四个SNP位点设计引物，并在上游引物的5`端分别连接Tag1/Tag2、Tag3/Tag4、Tag5/Tag6、Tag7/Tag8，同时用这四对Tag点制芯片，每个Tag重复点3个点，同时点上杂交阳性质控点PC 3个，杂交阴性质控点NC 3个，Blank点3个，Hex点3个。

进一步，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法包括设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物。

进一步，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法包括提取血样中的DNA，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，质检合格的DNA将浓度调整到50ηg/ul，-20℃储存备用。

进一步，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法包括PCR扩增，采用多重PCR扩增技术，每个反应总体积5ul，包含模板DNA 10ηg，Hotstar Taq 0.5U，扩增引物每条0.5pmol，25mM dNTP，0.1ul，反应条件为94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃。