[发明专利]一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法

权利要求书

1.一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法，以D,L-草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L-草铵膦，其特征在于，所述酶催化体系包括用于将D,L-草铵膦中的D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基（甲基）膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶突变体、以及用于将2-羰基-4-[羟基（甲基）膦酰基]丁酸催化还原为L-草铵膦的转氨酶，

所述D-氨基酸氧化酶突变体由野生菌Rhodotorula taiwanensis中的D-氨基酸氧化酶突变所得，突变位点选自以下两种中的一种：

（1）M213S-N54V-F58E-D207A；

（2）M213S-N54V-F58E-D207A-S60T，

野生菌Rhodotorula taiwanensis中的D-氨基酸氧化酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，

所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.39所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶突变体通过在反应体系中加入表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌获得；

所述转氨酶通过在反应体系中加入表达所述转氨酶的基因工程菌获得，同时还加有辅酶磷酸吡哆醛。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所用基因工程菌的宿主细胞均为E. coliBL21(DE3)。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，反应体系中D,L-草铵膦的终浓度为100~400mM，表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌添加量为20~40g/L，表达所述转氨酶的基因工程菌添加量为30~50g/L，所述辅酶磷酸吡哆醛的浓度为1mM。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，反应的温度为30℃，时间为10h，反应的pH值为8。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，反应完成后，终产物L-草铵膦分离提取的方法为预处理-离子交换法-结晶。

7.一种D-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，由野生菌Rhodotorula taiwanensis中的D-氨基酸氧化酶突变所得，突变位点选自以下两种中的一种：

（1）M213S-N54V-F58E-D207A；

（2）M213S-N54V-F58E-D207A-S60T，

野生菌Rhodotorula taiwanensis中的D-氨基酸氧化酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

8.编码如权利要求7所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQID No.5~6中的一种。

9.一种包含如权利要求8所述基因的基因工程菌。