[发明专利]一种基于三代测序的FMR1的检测引物、体系及方法

说明书

本发明涉及一种基于三代测序的FMR1的检测引物、体系及方法，包括使用自主设计的引物进行扩增，加入扩增增强剂，选用特定的扩增条件等等。本发明降低了FMR1扩增的难度，可同时检测基因型，三代测序检测全长，CGG重复的检出更精确。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于三代测序的FMR1的检测引物、体系及方法。

背景技术

脆性X综合征(FXS)发生的分子机制为FMR1基因DNA层面CGG重复。该重复会引起FMR1表达缺乏，该基因编码RNA结合蛋白脆性X蛋白(FMRP)，是负责智力迟滞的相关蛋白。该蛋白的缺乏会导致最常见的遗传性智力低下疾病-脆性X综合征。按正常人群中女性FMR1前突变携带率为1/130-1/256推算，中国目前有五百万至一千万女性潜在携带者。携带者有50％的几率将FMR1突变基因遗传给子女，子女存在着FMR1全突变而罹患脆性X综合征的风险。其风险率与母亲FMR1前突变CGG重复次数有关。重复次数越多其风险越高，按CGG的重复次数对个体进行分类，正常(5-54CGG重复)、前突变(55-200重复)或完全突变(200重复)，患病风险将从40％逐渐增加到100％。其中FMR1完全突变的男孩100％患病，女孩30％-40％患病。现在患者中发现的最多重复CGG序列230异常甲基化，导致FMR1基因转录沉默。其发病率仅次于先天愚型(21三体-唐氏综合征)。患儿表现为重度智力残疾，同时还伴有行为发育异常或容易患孤独症。

值得关注的是自发现脆性X综合征近50年来，现代医学一直无法进行有效而准确的产前筛查，导致大量的脆性X综合征患儿降生。给社会及数量众多的患儿家庭带来了无法逆转的痛苦和沉重的负担。目前的医学水平对此疾病尚无有效的治疗方法，产前诊断和选择性流产是唯一的预防手段。脆性X-FMR1基因现有的检测技术为Amplide X检测技术。该方法无法检测基因型。传统的检测FMR1基因突变的方法有Southern杂交法和普通PCR法。Southern杂交法费时、费力、DNA需要量大、灵敏度低(5-10％)，无法确定CGG重复数；普通PCR方法成本低，但高GC的片段干扰了了FMR1的扩增。因为大量的CGG重复用二代测序拼接有困难，因此只能用三代或一代进行测序来进行检测。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述技术问题，本发明人在进行了大量的深入研究之后，提供了一种基于三代测序的FMR1的检测引物、体系及方法。本发明提供的方法包括FMR1的引物设计，PCR扩增与三代测序结果分析。本发明通过设计高特异性的扩增引物，增加多种扩增增强剂，摸索扩增条件，调整扩增体系，采用三代的分析流程分析FMR1的CGG重复次数。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种基于三代测序的FMR1的检测引物，包括：

上游引物FMR1-F3：5'-gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcacCCGCGGAATCCCAGAGAGGCC-3'，

下游引物FMR1-R3：5'-tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtagGTCACTTAGCGCCGATTTCGGCC-3'。

本发明还提供了一种基于三代测序的FMR1的检测体系，包括上述引物。

优选地，上述检测体系还包括PCR扩增增强剂；更优选地，所述PCR扩增增强剂包括甘油及DMSO。

优选地，所述PCR扩增增强剂中，甘油的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，更优选5％，DMSO的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，更优选2.5％。

本发明还提供了一种基于三代测序的FMR1的检测方法，包括如下具体步骤：

(1)根据人FMR1的DNA序列，跨CGG重复区设计PCR引物；