[发明专利]间充质干细胞诱导成胰岛分泌细胞及胰岛素分泌检测方法

说明书

本发明涉及一种间充质干细胞诱导成胰岛分泌细胞及胰岛素分泌检测方法，其中，诱导方法包括：第一诱导步骤：取人脐带间充质干细胞，以2×10supgt;5/supgt;个/孔的细胞数铺于6孔细胞培养板中进行培养，待细胞汇合度达到70％时，弃去原培养液，并加入诱导培养液Ⅰ，置于培养箱中培养5d；第二诱导步骤：弃去诱导培养液Ⅰ，加入诱导培养液Ⅱ继续置于培养箱中培养3d；第三诱导步骤：弃去诱导培养液Ⅱ，加入诱导培养液Ⅲ继续置于培养箱中培养5d；第四诱导步骤：弃去诱导培养液Ⅲ，加入诱导培养液Ⅳ继续置于培养箱中培养14d后，得到目标细胞团并进行收集存储。本发明提供的诱导方法采用的诱导因子较少，步骤简单，且诱导率高。

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种间充质干细胞诱导成胰岛分泌细胞及胰岛素分泌检测方法。

背景技术

糖尿病是危害人类健康的重大疾患，其表现为胰岛素相对缺乏或绝对缺乏，并以持续性高血糖为主要生化特征的一种慢性全身性代谢疾病。目前主要治疗方法是口服降血糖药物或胰岛移植，口服降血糖药物不能从根本上解决问题，且患者需长期或者终生服药，而且存在药物副作用隐患，而进行胰岛移植不仅费用高、供体缺乏、风险大，还存在免疫排斥方面的问题。

研究表明Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病均与免疫损伤和炎症反应有密切的关系，因此有效抑制或阻断免疫损伤应具有保护β细胞免受损伤、维持胰岛功能和纠正胰岛素抵抗功效。间充质干细胞具有强大免疫抑制作用，已有报道及临床研究表明注射间充质干细胞能缓解糖尿病患者病情。同时研究表示间充质干细胞具有组织修复、促进血管生成、抗氧化、纠正糖尿病代谢紊乱和胰岛素抵抗等功能，可见间充质干细胞在糖尿病中可以发挥重要作用。

然而目前临床上认为胰岛移植是治愈糖尿病的方法之一，但是由于胰岛供体来源限制、胰岛细胞体外存活率及免疫排斥问题大大限制的临床的应用，因此糖尿病治愈方法还存在很大的改进空间。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种间充质干细胞诱导成胰岛分泌细胞及胰岛素分泌检测方法，可以为临床试验提供低成本、低风险的胰岛移植替代物。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种间充质干细胞诱导成胰岛分泌细胞的方法，包括：

第一诱导步骤：取人脐带间充质干细胞，以2×10⁵个/孔的细胞数铺于6孔细胞培养板中进行培养，待细胞汇合度达到70％时，弃去原培养液，并加入诱导培养液Ⅰ，置于培养箱中培养5d；

第二诱导步骤：弃去诱导培养液Ⅰ，加入诱导培养液Ⅱ继续置于培养箱中培养3d；

第三诱导步骤：弃去诱导培养液Ⅱ，加入诱导培养液Ⅲ继续置于培养箱中培养5d；

第四诱导步骤：弃去诱导培养液Ⅲ，加入诱导培养液Ⅳ继续置于培养箱中培养14d后，得到目标细胞团并进行收集存储。

作为本发明的一种优选方案，所述诱导培养液Ⅰ包括：25mMol/L的葡萄糖、10μg/L的重组人激活素-A、以及10μg/L的表皮细胞生长因子。

作为本发明的一种优选方案，所述诱导培养液Ⅱ包括：25mMol/L的葡萄糖、以及15mMol/L的尼克酰胺。

作为本发明的一种优选方案，所述诱导培养液Ⅲ包括：25mMol/L的葡萄糖、15mMol/L的尼克酰胺、以及10μg/L的肝细胞生长因子。

作为本发明的一种优选方案，所述诱导培养液Ⅳ包括：5.5mMol/L的葡萄糖、10μg/L的重组人激活素-A、15mMol/L的尼克酰胺、10μg/L的肝细胞生长因子、以及20nMol/L的Exendin-4。

作为本发明的一种优选方案，所述第四诱导步骤之后还通过双硫腙染色法进行胰岛分泌细胞的鉴定。